RNA。[Christoph Burgstedt/盖蒂图片社]
CRISPR从鲜为人知的细菌防御系统发展为分子“手术刀”的历程，始终依赖一个核心小组分：向导RNA（guide RNA）。多年来，这种经无数实验室精心设计、修饰及优化的向导RNA，一直被视为CRISPR系统不可更改的固有特征——CRISPR的切割位点由向导RNA决定，这是该系统的核心法则。
但一项新研究表明，CRISPR系统的灵活性远超学界此前的认知。该研究发表于《自然·生物技术》（Nature Biotechnology），题为《DNA引导的CRISPR–Cas12用于细胞内RNA靶向》。
佛罗里达大学的研究人员开发出首个以DNA而非RNA引导Cas酶靶向RNA的CRISPR系统。该平台名为ΨDNA，可重编程Cas12核酸酶，通过DNA型向导骨架识别并作用于RNA。研究作者表示，这一成果带来了一种调控细胞内RNA的全新方式，“将Cas12系统的应用范围从基因组编辑、诊断拓展至细胞转录组及其表观转录组标记的精准可编程调控”。
这一概念基于一个基础的生物学特性差异：DNA储存细胞的长期遗传指令，而RNA是遗传指令的工作拷贝。“这些RNA拷贝就像原始操作手册的复印件，有时复印件会存在错误”，该研究的通讯作者、佛罗里达大学化学工程副教授Piyush Jain博士解释道。这些工作拷贝的错误会诱发疾病，而靶向RNA为疾病干预提供了一条无需改变底层基因组的途径。但现有RNA引导的CRISPR系统（如Cas13系统）存在稳定性差、脱靶效应的问题。“现有靶向RNA的CRISPR系统依赖RNA向导寻找靶点，尽管有效性已得到验证，但它们有时会作用于非预期分子，同时合成成本高、稳定性较差。”Jain表示。
ΨDNA采用了完全不同的设计思路。研究团队改造了一种反向模拟CRISPR RNA（crRNA）骨架的DNA向导，使AsCas12a和Cas12i1能够结合RNA，并触发强烈的单链DNA反式切割（trans-cleavage）活性。正如研究摘要所述：“ΨDNA可实现Cas12核酸酶的RNA靶向……在临床样本中丙肝病毒RNA检测的准确率可达100%。”在人类细胞系中，ΨDNA可通过核糖体停滞、募集核糖核酸酶H1（RNase H1）等机制，实现对内源RNA转录本70%~95%的敲低效率。
Jain认为这项工作实现了CRISPR领域的概念革新。“最具意义的进展是，我们证明CRISPR-Cas12可被重编程为通过DNA向导而非RNA向导靶向RNA，这对整个领域而言是真正的概念性突破。”截至目前，RNA靶向领域始终由RNA引导的系统主导。ΨDNA证明，传统上作为DNA编辑器的Cas12酶可被重定向靶向RNA，“同时保持高特异性，可实现多种功能：包括用于诊断开发的RNA检测、细胞内RNA敲低、多重靶向、DNA与RNA双靶向，以及用于RNA修饰及潜在治疗策略的效应子融合策略。”
这一发现源于对一个结构谜题的破解。单纯将RNA碱基替换为DNA碱基无法实现功能，学界此前认为Cas12酶严格依赖RNA骨架发挥功能。“多个研究团队曾尝试开发DNA引导的CRISPR/Cas系统，但仅将RNA碱基替换为DNA碱基的方案均以失败告终。”Jain表示。突破来自于研究团队改造了一个3"端DNA手柄，重构了crRNA的骨架结构。突变筛选显示茎环结构是其活性的必需元件，而与得克萨斯大学奥斯汀分校David Taylor团队合作解析的最新冷冻电镜（cryo-EM）结构显示，AsCas12a的结构灵活性远超预期，可容纳结合了RNA靶标的DNA向导。
最令研究团队意外的是该系统的稳定性极强。“尤其令人振奋的是，这并非仅能在体外（in vitro）实现的新奇现象”，Jain表示。ΨDNA可应用于临床RNA检测，在丙肝病毒样本中检测准确率达100%，且在细胞内的脱靶效应低于Cas13d。
该平台的模块化特性或许是其最强大的优势。ΨDNA可与核糖核酸酶H1融合实现靶向RNA降解，也可与甲基转移酶样蛋白3（METTL3）融合实现表观转录组编辑。由于crRNA和ΨDNA可共递送，单个Cas12a酶可同时运行两种工作模式。“单个Cas12a效应子可同时编辑DNA并调控RNA，这项工作开始模糊了二者的功能边界。”Jain表示。
展望未来，研究团队正在同时拓展该平台的机制研究和转化应用：他们正在优化向导设计规则，解析ΨDNA引导的Cas12触发RNA敲低的机制，并探索其在诊断、多重RNA调控、离体（ex vivo）治疗场景中的应用，其中一个新兴方向是利用该技术在移植前修复供体器官。
从更广泛的应用角度来看，DNA向导具备诸多实用优势：与RNA向导相比，DNA向导更易合成、稳定性更高、规模化生产潜力更强。这些特性组合使ΨDNA有望成为基础研究、诊断及未来治疗性改造领域的通用平台。
CRISPR研究围绕RNA引导系统发展了数十年后，ΨDNA为调控这一生物学领域最强大的工具之一提供了新的方式。正如Jain所言：“从本质上看，这项研究为我们提供了更精准的调控能力——我们不仅能改写遗传操作手册，还能精准控制这些指令的使用方式。”
专业注释
- 表观转录组：RNA上的可逆化学修饰，可调控RNA功能及基因表达
- 反式切割：核酸酶结合靶标后切割非特异性旁侧核酸的活性
- 冷冻电镜：解析生物大分子高分辨率三维结构的核心技术