图片来源：Christoph Burgstedt/科学图片库/Getty Images
大家去眼科配新处方眼镜时，是不是有过一瞬间整个世界突然变得格外清晰的体验？加州大学伯克利分校的物理学家如今为电子显微镜实现了类似的突破。通过在冷冻电子显微镜（cryo-EM）中引入相衬技术，研究团队获得了生物学领域尺寸最小、最难捕获的一类蛋白的高清晰度图像。
这项突破依托新型激光相板（laser phase plate, LPP）实现，相关研究成果以《激光相板提升冷冻电镜解析小蛋白结构的能力》为题发表于近期的《科学》（Science）期刊。该研究由加州大学伯克利分校、劳伦斯伯克利国家实验室的物理学家Holger Mueller博士牵头，研究团队证实激光驱动相板可解决冷冻电镜长期存在的一大局限：小蛋白成像对比度差。
分别在未使用和使用激光相板条件下采集的apo载铁蛋白、血红蛋白两种蛋白的冷冻电镜图像。采集的图像经计算机分析后可得到蛋白的精细三维结构。[图片来源：Holger Müller，Jessie Zhang/加州大学伯克利分校]
过去十年间，冷冻电镜彻底革新了结构生物学领域，该技术无需蛋白结晶即可解析高分辨率结构，相关研究成果于2017年获得诺贝尔奖。但尽管应用价值突出，该技术仍难以解析分子量低于约70千道尔顿的蛋白——而人类蛋白质组中约90%的蛋白都处于这一分子量范围。“受信噪比限制，绝大多数人和动物的蛋白尺寸过小，无法通过冷冻电镜和冷冻电子断层扫描技术分析。这款激光相板提升了信噪比，有望突破这些重要的技术瓶颈。”
新型激光相板正是为解决这一问题开发的。该装置利用高强度连续激光改变电子束自身的相位，在不降低电子束亮度、不破坏电子束稳定性的前提下实现了真正的相衬成像。Mueller介绍，该激光的聚焦参数为“75千瓦功率聚焦至几微米范围……其能量高于焊接用激光，也超过军用激光的功率，是目前全球亮度最高的连续激光聚焦装置。”
将激光相板安装到定制款赛默飞世尔Titan Krios电镜后，小蛋白的成像清晰度与可解析度立即得到提升，其中包括处于当前冷冻电镜解析分子量下限的血红蛋白。正如研究人员在摘要中所述：“本研究证实，激光相板可通过优化样品位移校正、恢复早期成像帧的信息，同时提升颗粒可视化效果、三维分类与比对准确度，进而提升小蛋白单颗粒重构的分辨率。”
激光（紫色）经高抛光镜强效放大后聚焦于电子束（蓝色），改变电子束相位以提升冷冻电镜的对比度，帮助生物学家对更小的蛋白以及细胞内致密的结构成像。[图片来源：Sayo Studio]
上述性能提升可在标准离焦范围与常规重构工作流条件下实现。Mueller表示：“对于最具挑战性的场景——小颗粒样品、质量不佳的样品，激光相板的优势非常显著。”
该技术的应用场景不止于单颗粒分析。冷冻电子断层扫描技术（cryo-ET）通过采集分子或蛋白的多个角度视图拼接得到三维图像，该技术将从激光相板的应用中获益更多。陈·扎克伯格生物中心成像技术创始主任Bridget Carragher博士表示：“利用冷冻电子断层扫描技术观察细胞内部时，我们研究的是小而极为复杂的细胞组分，细胞内部的结构极其致密，就像在一片森林里找某一棵树上的某一片叶子。冷冻电子断层扫描技术亟需对比度的大幅提升，才能帮助我们解析细胞内部的生理过程，而激光相板恰好有望实现这一目标。”
陈·扎克伯格生物中心正在开发双激光版本的系统，旨在降低组件损耗并最小化像差。与此同时，Mueller团队正致力于实现分子量低至17千道尔顿的蛋白成像，这一阈值将让研究人员得以解析此前冷冻电镜无法观测到的人类蛋白质组的绝大部分组分。
陈·扎克伯格生物中心成像科学副总裁Stephani Otte博士表示：“这项技术是生物学领域的阶跃式突破，过去无法观测的结构现在将清晰呈现，这将彻底改变我们对疾病的认知方式。”
Mueller指出：“本质而言，如果你研究的是大蛋白，且样品质量很好——比如新鲜样品、冷冻过程没有产生气泡，那么你可能不需要相板也能得到高质量的单张图像。但如果研究的是小蛋白、样品质量不佳，开启激光相板是最优选择。该技术可填补我们在蛋白结构认知中的巨大空白，覆盖那些无法结晶、或是尺寸过小难以被现有冷冻电镜解析的蛋白，同时也将为冷冻电子断层扫描技术带来革命性的变化。”
专业注释
- 冷冻电子显微镜（cryo-EM）：无需结晶的生物大分子高分辨成像技术
- 激光相板（LPP）：提升冷冻电镜成像对比度的新型配套装置
- 千道尔顿（kDa）：生物大分子分子量常用计量单元
- 冷冻电子断层扫描（cryo-ET）：可解析细胞内原位结构的电镜技术