图注：正在吸血的冈比亚按蚊雌虫（来源：Oxford Scientific / Photodisc/ Getty Images）
近半个世纪以来，科研人员已知疟原虫通过一种名为移动连接体（moving junction, MJ）的环形结构侵入人体红细胞，但其具体功能始终未被阐明。该结构的组装、发挥功能和解聚过程仅需60秒，研究人员尚未来得及精细解析便已消失。
哥伦比亚大学的研究团队最终捕捉到了移动连接体发挥功能的动态过程。研究人员在疟原虫启动入侵时将其冷冻，直接从细胞中分离出完整的复合物，首次获得了该结构的高分辨率三维构象。这一发现推翻了持续数十年的关于疟原虫入侵机制的假说：移动连接体并非被动的入侵通道，而是一种可主动重塑宿主细胞膜、协助疟原虫侵入胞内的分子机器。
研究结果详细阐述了团队解析该结构的过程，并且以此为蓝图从头设计了一种可阻断疟原虫入侵的微型蛋白，为新型抗疟药物的研发提供了概念验证。
“数十年来我们已知该结构是疟原虫入侵细胞的必需元件，但始终不清楚其作用机制”，哥伦比亚大学瓦格洛斯内科与外科医学院微生物与免疫学系助理教授、该研究的通讯作者Chi-Min Ho博士表示，“直接从疟原虫中分离得到完整的复合物，让我们终于能够直接解答这一问题。”
Ho博士团队的研究成果已发表于《细胞》（Cell）期刊，论文题为《入侵型疟原虫结合并重塑宿主膜的结构基础》。团队在论文摘要中指出：“本研究是破解数十年来围绕疟疾移动连接体结构与功能的谜团的重要进展，彰显了天然结构解析的研究价值，也为下一代抗疟药物的结构导向设计奠定了基础。”
目前疟疾每年仍导致约60万人死亡，其中绝大多数为撒哈拉以南非洲的幼儿，且疟原虫对一线药物的耐药性正逐步提升。论文作者写道：“疟疾的发病率与死亡率直接与恶性疟原虫（Plasmodium falciparum）在人体红细胞中的入侵和复制过程相关。”疟原虫的生活史需要人和按蚊两种宿主，可感染人体的红细胞、肝细胞以及按蚊的唾液腺。
疟疾的发病起始于疟原虫侵入红细胞这一单一事件。研究团队指出：“疟原虫通过快速、高度有序的过程侵入宿主细胞，从而建立感染”。在感染者体内，每48小时就会有数以万亿计的疟原虫同步释放并侵入新的细胞，这种周期性的破裂和再侵染循环正是疟疾特征性周期性发热的诱因。研究人员解释称：“在滑行、调整方向和初始附着后，疟原虫的内化过程由移动连接体的形成启动，该结构可将疟原虫锚定在宿主细胞上。”
这种移动连接体的作用机制在疟原虫的所有物种和生活史所有阶段均保守，因此也成为疟疾研究领域最受关注的靶点之一。对于抗疟药物和疫苗研发而言，阻断该结构即可从源头阻止感染发生。
移动连接体的谜题最早可追溯至1978年，当时科研人员首次通过电子显微镜观察到疟原虫与细胞接触的膜区域存在一种未知的增厚结构。后续研究人员最终鉴定出了构成该连接体基本元件的4种疟原虫蛋白：顶端膜抗原1（AMA1）、棒状体颈部蛋白2（RON2）、棒状体颈部蛋白4（RON4）和棒状体颈部蛋白5（RON5），并且证实这4种蛋白均为疟原虫入侵所必需。但该结构的具体功能仍不明确，因为其仅能存活约1分钟，且无法在试管中重组。研究人员表示：“由于该复合物寿命极短（60~90秒），且难以在异源系统中重构以开展详细的生化和结构研究，填补这一关键认知空白的相关研究一直受到阻碍。”
哥伦比亚大学团队通过在入侵过程中阻断疟原虫的方式解决了这一难题。研究人员使用一种可抑制疟原虫内部马达蛋白、但不影响移动连接体形成的化合物，将正在侵入红细胞的疟原虫停滞在入侵中途，随后提取出完全组装的AMA1-RON复合物（即整个移动连接体的核心构建元件），并通过冷冻电子显微镜（cryo-EM）对其进行成像。冷冻电镜技术可将分子快速冷冻，利用电子束在极高放大倍数下成像，从而在原子水平解析分子的构象。最终研究人员获得了该构建元件的清晰三维结构，发现其形状酷似帆船：AMA1蛋白构成细胞表面上方的“帆”，3种RON蛋白构成向下压在细胞膜上的宽阔“船体”。
最令人意外的发现来自于“船体”结构，研究人员从中找到了最终揭示移动连接体入侵功能的线索。该结构压在宿主膜上的表面布满了带正电的锚定结构，同时表面分布的短螺旋可像楔子一样深入膜内。“这些短螺旋不对称地插入膜的单侧小叶，置换脂质头部，施加侧向压力以引发局部膜变形。”
这两种特征是一类已知的可弯曲、重塑膜结构的细胞机器的公认标志。研究人员在报告中指出，他们的结构发现揭示了“一种高度特殊的分子订书钉结构，具备强效膜重塑机器的典型特征”。
为验证该结构确实可使膜发生变形，研究人员合成了疟原虫的楔状螺旋结构，并将其添加到人工膜泡中，结果发现膜发生变薄和破裂；而功能减弱的突变体螺旋则不会破坏膜泡的完整性。研究团队据此推断，移动连接体可牵拉宿主膜发生形变，很可能与疟原虫的马达蛋白协同作用，将疟原虫撬入细胞内部。
“此前学界认为移动连接体是一系列订书钉或点焊结构，构成一个被动的环形通道，供疟原虫拖拽自身穿过”，该研究的第一作者、Ho实验室的博士生Meseret Haile表示，“而我们的研究发现它是一种可重塑宿主细胞膜的分子机器，这完全改变了我们对整个入侵事件的认知。”团队在论文中补充道：“本研究表明，尽管移动连接体在形态上与经典的紧密连接类似，但其功能存在本质差异：它并非静态的黏附分子，而是一种动态的门户结构，可协调调控疟原虫的内化过程。”
除了最终揭示移动连接体协助疟原虫入侵的机制之外，该结构还为研究团队提供了AMA1结合其伴侣蛋白的精准位点和作用模式，这一相互作用是维持整个移动连接体完整性的核心。研究人员结合解析得到的结构信息，利用机器学习驱动的蛋白设计工具，设计了一种可破坏该相互作用的微型蛋白。筛选得到的最优候选分子可剂量依赖性地阻断疟原虫侵入红细胞，且对已被感染的细胞无影响，证实其是通过特异性阻断疟原虫入侵发挥作用，而非非特异性毒性。
这种人工设计的微型蛋白仅为概念验证产物，并非成品药物，还需要大量优化才可进入人体试验阶段。但它证实了一种极具潜力的新策略：利用接近天然状态的结构设计可阻断入侵的微型蛋白，靶向传统研发策略难以攻克的靶点。该结构还阐明了数种领先抗疟抗体的作用机制，相关信息可用于优化疫苗设计。研究人员写道：“我们的成功概念验证，彰显了针对复杂系统的情境驱动结合剂设计的潜力，为抗疟治疗干预提供了前所未有的新路径。除了治疗潜力之外，这些结合剂也可作为功能研究工具，用于探究特定蛋白相互作用的功能相关性。”
“一旦我们观察到了靶点的天然构象，设计阻断分子就变成了一个可解决的问题，这也是我们最希望后续深入拓展的方向”，Ho实验室主导抑制剂设计的医学-理学双学位博士生Daphne Kaxiras表示。
该团队直接从生物体中捕获脆弱复合物进行成像、并以此指导分子设计的研究策略，也可应用于其他众多难以研究的寄生虫和病原体研究中。
专业注释
- 移动连接体：疟原虫入侵宿主细胞时形成的保守环形超微结构
- 冷冻电子显微镜：可解析生物大分子原子分辨率构象的成像技术
- 棒状体颈部蛋白（RON）：疟原虫分泌的入侵相关核心蛋白家族