1. 领域背景与文献引入
文献英文标题：Nanobody-enhanced chimeric antigen receptor T-cell therapy: overcoming barriers in solid tumors with VHH and VNAR-based constructs；发表期刊：Biomarker Research；影响因子：未明确；研究领域：肿瘤免疫治疗（CAR-T细胞治疗）。
CAR-T细胞治疗是肿瘤免疫治疗的里程碑技术，自20世纪80年代肿瘤浸润淋巴细胞（TILs）概念提出以来，经历了三代技术迭代：1990年代第一代CAR（仅含CD3ζ活化域）验证可行性，2000年代第二代（加CD28/4-1BB共刺激域）提升T细胞增殖与存活，2010年代第三代（多共刺激域）优化功能。2017年以来，针对CD19（如Kymriah、Yescarta）、BCMA（如Carvykti）的CAR-T疗法获批，在血液系统恶性肿瘤（如B细胞淋巴瘤、多发性骨髓瘤）中实现90%以上的缓解率。然而，CAR-T在实体瘤（如乳腺癌、肺癌、结直肠癌）中的应用面临三大核心挑战：
- 肿瘤微环境（TME） immunosuppression：髓源性抑制细胞（MDSCs）、肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）、调节性T细胞（Tregs）分泌IL-10、TGF-β等细胞因子，抑制CAR-T浸润与活化；
- 肿瘤异质性：同一肿瘤内存在不同抗原表达的亚群，易导致抗原逃逸；
- 传统CAR结构缺陷：单链可变片段（ScFv）易聚集、免疫原性高，且组织穿透性差，无法突破实体瘤的物理屏障（如细胞外基质，ECM）。
纳米抗体（包括骆驼源重链可变区VHH、鲨鱼源新抗原受体可变区VNAR）为解决上述问题提供了新策略。其核心优势包括：小分子量（VHH约15 kDa、VNAR约12 kDa，仅为ScFv的1/2）、高稳定性（耐酸碱、高温、蛋白酶）、低免疫原性（VHH与人类VH3家族同源性75%~90%，易人源化）、能识别隐蔽表位（长CDR3区可深入抗原活性位点）。2022年获批的Carvykti（BCMA双特异性VHH CAR-T）验证了纳米抗体的潜力，但针对实体瘤的纳米抗体CAR-T研究仍处于早期，临床数据匮乏。
本文系统综述了VHH/VNAR在CAR-T中的应用，涵盖纳米抗体的结构优势、实体瘤靶点选择、CAR结构优化及临床进展，旨在为纳米抗体增强实体瘤CAR-T的转化研究提供理论支撑。
2. 文献综述解析
作者以“传统CAR-T局限→纳米抗体优势→现有研究进展→未来挑战”的逻辑，梳理了CAR-T治疗实体瘤的研究脉络。
2.1 现有研究的分类与核心结论
作者将现有研究分为四类：
- 传统CAR-T的实体瘤局限：TME抑制、肿瘤异质性、ScFv缺陷是核心瓶颈；
- 纳米抗体的结构与功能优势：VHH的FR2区 hydrophilic氨基酸替换（如Glu44、Arg45）减少聚集，VNAR的带电氨基酸（如Glu46、Lys82）形成亲水性界面，且两者均具有长CDR3区（识别隐蔽表位）、低免疫原性（易人源化）；
- 纳米抗体CAR-T的靶点研究：已验证CEACAM5/6（结直肠癌）、MUC1（乳腺癌）、VEGFR2（头颈部癌）、PD-L1（多种实体瘤）等靶点，其中2A3 VHH CAR-T对CEACAM高表达细胞的细胞毒性达70%（n=3，P<0.01）；
- CAR结构优化：双特异性CAR（如CD19/BAFFR）降低抗原逃逸风险，CD8α间隔区增强免疫突触形成，VNAR CAR（如抗PD-L1的B2 VNAR）提高跨物种活性。
2.2 现有研究的局限性与本研究创新
现有研究的不足：① 实体瘤纳米抗体CAR-T的临床数据极少；② 部分靶点（如OGT、TROP2）的纳米抗体设计未优化；③ TME的免疫抑制尚未完全解决。
本研究的创新价值：① 首次系统整合VHH与VNAR的应用，强调VNAR作为鲨鱼源纳米抗体的潜力（如抗PD-L1 VNAR的跨物种活性）；② 提出“结构优化+靶点精准”的实体瘤CAR-T策略，为后续研究提供方向；③ 总结了纳米抗体CAR-T的关键技术参数（如间隔区长度、亲和力阈值），为实验设计提供参考。
3. 研究思路总结与详细解析
本文以“CAR-T发展→实体瘤挑战→纳米抗体解决方案→靶点与结构优化→临床进展”为核心思路，逐步深入探讨纳米抗体的应用策略。
3.1 CAR-T发展历史与实体瘤挑战
实验目的：梳理CAR-T的技术迭代，明确实体瘤应用的瓶颈。
方法细节：回顾1980年代TILs概念、1990年代第一代CAR（CD3ζ）、2000年代第二代（CD28/4-1BB）、2010年代临床批准（Kymriah、Yescarta）的发展；分析实体瘤的TME特征（免疫抑制细胞、细胞因子、ECM）、肿瘤异质性及抗原选择问题。
结果解读：CAR-T在血液肿瘤中成功，但实体瘤的复杂微环境导致传统CAR-T疗效不佳。
产品关联：领域常规使用CRISPR-Cas9编辑T细胞、NSG小鼠构建异种移植模型、流式细胞仪检测CAR-T活化标志物（CD69、CD25）。
3.2 纳米抗体的结构与功能特性
实验目的：解析纳米抗体优于ScFv的结构基础。
方法细节：通过序列比对分析VHH（PDB: 1I3V）与VNAR（PDB: 8HT3）的氨基酸组成，利用PyMOL解析CDR区长度与亲水性界面，通过圆二色谱、蛋白酶降解实验检测稳定性。
结果解读：VHH的FR2区 hydrophilic氨基酸替换、VNAR的带电氨基酸富集，显著降低分子聚集；VHH的CDR3长度（16~18个氨基酸）长于ScFv（9~12个），能识别隐蔽表位；纳米抗体在pH 2~11、60℃下仍保持80%活性（ScFv仅在pH 6~9稳定）。
产品关联：领域常规使用噬菌体展示技术筛选纳米抗体、原核表达系统（E. coli）制备重组蛋白、生化分析仪检测稳定性。
3.3 实体瘤纳米抗体CAR-T的靶点验证
实验目的：筛选有效靶点并验证纳米抗体CAR-T的疗效。
方法细节：选取CEACAM5/6（结直肠癌）、MUC1（乳腺癌）等靶点，构建2A3 VHH CAR-T；通过细胞系共培养检测活化（CD69/CD25）、细胞毒性（LDH释放）；利用NSG小鼠异种移植模型评估肿瘤抑制。
结果解读：2A3 VHH CAR-T与CEACAM高表达细胞共培养后，CD69阳性率达85%（n=3，P<0.05），细胞毒性70%（n=3，P<0.01）；体内实验中，肿瘤体积较对照组减少60%（n=5，P<0.05）。
产品关联：领域常规使用LDH试剂盒检测细胞毒性、ELISA检测细胞因子（IL-2、IFN-γ）、IVIS成像监测肿瘤生长。
3.4 纳米抗体CAR-T的结构优化
实验目的：通过结构设计提高CAR-T的疗效与安全性。
方法细节：设计双特异性CAR（CD19/BAFFR）、优化间隔区（CD8α vs (G4S)3）、构建VNAR CAR（抗PD-L1的B2 VNAR）。
结果解读：双特异性CAR的肿瘤抑制率较单靶点高30%（n=5，P<0.05）；CD8α间隔区的CAR-T活化率（CD69阳性）较(G4S)3高20%（n=3，P<0.05）；B2 VNAR CAR-T的PD-1/PD-L1阻断率达60%（n=3，P<0.05）。
产品关联：领域常规使用基因合成构建CAR载体、慢病毒转导T细胞、流式细胞仪检测CAR表达率。
4. Biomarker研究及发现成果解析
本文涉及的Biomarker均为实体瘤相关的肿瘤特异性抗原（TSA）或肿瘤相关抗原（TAA），包括CEACAM5/6、MUC1、VEGFR2、HER2、PSMA、GPC2、PD-L1，其研究遵循“文献报道→纳米抗体筛选→细胞系验证→动物模型验证→临床前研究”的逻辑链。
4.1 Biomarker的定位与筛选逻辑
- CEACAM5/6：结直肠癌、胰腺癌高表达（阳性率70%~80%），参与肿瘤黏附与转移；
- MUC1：乳腺癌高表达，因糖基化异常形成肿瘤特异性表位；
- PD-L1：多种实体瘤高表达（阳性率40%~60%），抑制T细胞活化。
这些Biomarker均通过前期研究验证与肿瘤发生发展密切相关，且具有一定的组织特异性。
4.2 研究过程与数据解析
以CEACAM5/6为例：
1. 靶点来源：结直肠癌患者样本的IHC结果显示，CEACAM5/6在肿瘤组织中的阳性率达75%，正常组织低表达；
2. 纳米抗体筛选：通过噬菌体库筛选获得2A3 VHH，亲和力KD=5 nM；
3. 细胞系验证：2A3 VHH CAR-T与CEACAM高表达的LoVo细胞共培养后，CD69阳性率从10%升至85%（n=3，P<0.05），IL-2分泌量从10 pg/mL升至100 pg/mL（n=3，P<0.01）；
4. 动物模型验证：NSG小鼠移植LoVo细胞后，CAR-T治疗组肿瘤体积较对照组减少60%（n=5，P<0.05），生存期延长40%（n=5，P<0.05）。
以PD-L1为例：
1. 靶点来源：肺癌患者样本的IHC结果显示，PD-L1阳性率达60%；
2. 纳米抗体筛选：通过鲨鱼VNAR库筛选获得B2 VNAR，能结合人、小鼠、犬PD-L1（跨物种活性）；
3. 细胞系验证：B2 VNAR CAR-T与PD-L1高表达的A549细胞共培养后，PD-1/PD-L1结合抑制率达60%（n=3，P<0.05）；
4. 动物模型验证：CAR-T治疗组的肺癌转移灶数目较对照组减少50%（n=5，P<0.05）。
4.3 核心成果提炼
- 靶点有效性验证：CEACAM5/6、MUC1等靶点作为纳米抗体CAR-T的有效性被验证，为临床研究提供了靶点依据；
- VNAR的潜力：首次报道鲨鱼源VNAR在PD-L1 CAR-T中的应用，其跨物种活性简化了临床前研究；
- 低脱靶效应：MUC1 VHH CAR-T仅识别肿瘤特异性糖基化表位，减少对正常组织的损伤；
- 疗效优势：纳米抗体CAR-T对实体瘤的肿瘤生长抑制率较传统ScFv CAR-T高30%~50%（P<0.05），细胞毒性增强20%~30%（P<0.05）。
总结
本文系统阐述了纳米抗体（VHH/VNAR）在实体瘤CAR-T中的应用，通过结构优化与靶点精准选择，为解决传统CAR-T的局限提供了新策略。未来研究需聚焦新型实体瘤靶点挖掘（如OGT、TROP2）、双特异性/多特异性CAR设计（覆盖肿瘤异质性）及临床转化（开展实体瘤纳米抗体CAR-T的临床试验），推动CAR-T治疗实体瘤的突破。