1. 领域背景与文献引入
文献英文标题：Whole gene expression profile in blood reveals multiple pathways deregulation in R6/2 mouse model；发表期刊：Biomarker Research；影响因子：未公开；研究领域：亨廷顿病（HD）分子病理与生物标志物研究。
亨廷顿病是一种致命的常染色体显性神经退行性疾病，核心病因是HTT基因第1外显子CAG三核苷酸重复异常扩增（正常6-26次，患者>36次），导致突变亨廷顿蛋白（mut-HTT）折叠错误并形成胞内包涵体，最终引发纹状体、大脑皮层神经元进行性丢失。其病理机制涉及转录失调（mut-HTT扣押CREB结合蛋白等转录因子）、线粒体功能障碍、氧化应激及免疫异常等。近年来，随着对mut-HTT“泛组织表达”特性的认识，外周组织（如血液、肌肉）的病理变化成为研究热点——外周组织不仅是mut-HTT的“储存库”，其分子改变还可能反映中枢神经系统的病变状态，为HD的早期诊断、病情监测提供无创生物标志物。
然而，作为HD研究的经典转基因小鼠模型（表达mut-HTT外显子1，12-16周出现运动障碍、体重下降等症状），R6/2小鼠的血液全基因表达谱尚未被系统分析，外周通路失调与中枢病变的关联也缺乏直接证据。本研究旨在填补这一空白，通过R6/2小鼠血液转录组测序结合多组织验证，揭示HD相关的外周通路异常，为生物标志物开发和治疗靶点探索提供实验依据。
2. 文献综述解析
文献综述以“HD核心病理→动物模型价值→现有研究局限”为评述逻辑，系统梳理领域现状：
首先，综述明确HD的分子病因是HTT基因CAG扩增导致mut-HTT的毒性作用，核心病理机制包括mut-HTT对转录 machinery的干扰（如抑制CREB介导的基因表达）、线粒体呼吸链损伤及氧化应激增加。其次，强调R6/2小鼠在HD研究中的不可替代性——该模型因携带mut-HTT外显子1、发病早、表型稳定，成为研究HD病理和测试治疗策略的“金标准”。
现有研究的优势在于：通过人类HD患者血液转录组（如Borovecki等2005年报道免疫相关基因失调）或蛋白质组分析，揭示了HD的免疫异常（补体系统激活）、代谢紊乱（PPAR信号失调）；局限性在于：① 缺乏R6/2小鼠血液全基因表达谱的系统解析，无法直接对比动物模型与人类的外周病理关联；② 外周组织（如骨骼肌、皮肤）与中枢的病理联动研究不足，难以明确外周变化是中枢病变的“镜像反映”还是“独立驱动因素”。
本研究的创新点正是针对这些局限：首次对R6/2小鼠血液进行全基因表达谱测序，结合基因集富集分析（GSEA）系统解析失调通路，并通过RT-qPCR验证血液、骨骼肌、皮肤和脑等多组织的基因表达差异，建立了外周通路失调与中枢病变的关联，为HD生物标志物的跨物种验证提供了实验基础。
3. 研究思路总结与详细解析
本研究的整体框架为“样本收集→转录组分析→通路富集→多组织验证→关联分析”，核心目标是解析R6/2小鼠血液中的转录失调通路，并验证其在其他外周组织及脑中的表达差异，揭示HD的外周-中枢病理关联；核心科学问题是“R6/2小鼠血液中哪些通路因mut-HTT表达而失调，且这些失调是否参与HD的外周或中枢病理过程”。
3.1 实验动物与样本收集
实验目的是获取R6/2转基因小鼠（HD模型）与野生型（WT） littermate的血液及多组织样本，为后续转录组分析提供材料。
方法细节：研究纳入4只R6/2雄鼠（携带约110次CAG重复）和4只WT雄鼠，均饲养于12/12光暗周期、20-23℃环境中，自由饮食。16周龄时（R6/2进入症状显性期），通过心脏穿刺采集麻醉小鼠的全血（加入RNAprotect Animal Blood Tubes稳定RNA），随后收集脑（含纹状体和皮层）、骨骼肌（股四头肌）和腹部皮肤样本。所有样本经RNA质量检测（RIN值8.4-9.0），其中1只WT小鼠的血液RNA因质量不达标被排除，最终用于微阵列分析的样本为4只R6/2和3只WT。
结果：成功获得合格的血液及组织样本，为后续转录组和验证实验奠定基础。
实验所用关键产品：RNAprotect Animal Blood Tubes（BD QIAGEN，货号76544）、RNeasy Protect动物血液试剂盒（QIAGEN）。
3.2 血液全基因表达微阵列分析
实验目的是通过全基因表达谱分析，筛选R6/2与WT小鼠血液中的差异表达基因。
方法细节：从合格血液样本中提取总RNA，取500ng RNA制备扩增RNA（aRNA），杂交至Affymetrix Mouse Genome 430 2.0芯片（覆盖>34000个小鼠基因）。芯片数据通过R软件（Bioconductor包）处理：用RMA包进行分位数归一化，median-Polish算法总结探针集信号；用LIMMA包分析差异表达（筛选标准：p<0.05，绝对折叠变化|FC|>1.3）。
结果：共鉴定出约2200个差异转录本，其中1072个在R6/2中上调，1164个下调；进一步筛选出23个高度差异的探针集（p<0.001，|FC|>2），聚类分析可清晰区分R6/2与WT样本（图1）。
实验所用关键产品：Affymetrix Mouse Genome 430 2.0芯片，实验由Precision Biomarker Resources完成。
3.3 通路富集分析（GSEA）
实验目的是从差异表达基因中富集出具有生物学意义的通路，揭示R6/2小鼠血液中的通路失调模式。
方法细节：使用GSEA 2.07软件，基于MSigDB数据库的KEGG、Reactome、BioCarta通路集合及GeneOntology的生物学过程（Biological Processes），对微阵列数据进行通路富集分析（显著性标准：虚假发现率FDR<25%）。
结果：KEGG分析显示，R6/2小鼠血液中有19条通路显著富集（如补体与凝血 cascade、PPAR信号通路），2条通路在WT中富集（心肌收缩、扩张型心肌病）；Reactome分析发现14条上调通路（如脂代谢相关通路）；BioCarta分析有3条上调通路。其中，补体与凝血 cascade是R6/2中富集最显著的通路，PPAR信号通路次之（表1）。
（补体与凝血 cascade通路图：红色标注为R6/2中上调的核心基因）
（PPAR信号通路图：红色标注为R6/2中上调的核心基因）
实验所用关键工具：GSEA 2.07软件，领域常规使用此类通路富集分析工具。
3.4 RT-qPCR验证与多组织分析
实验目的是验证微阵列结果的可靠性，并分析差异基因在其他外周组织（肌肉、皮肤）及脑中的表达情况，建立外周与中枢的病理关联。
方法细节：首先将R6/2和WT的血液RNA分别混合成Pooled样本（消除个体差异），用QuantiTect Reverse Transcription kit反转录为cDNA；对于肌肉、皮肤和脑样本，每个样本单独反转录。随后，用CFX96实时PCR系统（Bio-Rad）和iQ SYBR Green master mix，对候选基因（补体与凝血 cascade的C3、Serping1；PPAR信号的Fabp1、Slc27a2；心肌相关的Tpm2、Slc8a1）进行RT-qPCR检测。血液样本的表达数据归一化至Ppib、Actb、Ywhaz、Rpl13a的几何均值，其他组织归一化至Actb、B2m、Hprt、Rpl13a（骨骼肌排除Actb）。统计学分析采用Student’s t-test（p<0.05为显著）。
结果：① 血液中候选基因的表达趋势与微阵列一致（C3、Serping1、Slc27a2、Fabp1上调，Tpm2、Slc8a1下调）；② 骨骼肌中C3、Serping1显著下调（p<0.05），提示肌肉局部补体通路抑制；③ 脑中有C3上调、Tpm2下调、Serping1下调（p<0.05），其中Serping1的表达趋势与血液相反（图6-9）。
（血液RT-qPCR结果：Pooled样本验证微阵列趋势）
（骨骼肌RT-qPCR结果：C3、Serping1显著下调，*p<0.05）
（脑RT-qPCR结果：C3、Tpm2、Serping1显著差异，*p<0.05）
实验所用关键产品：QuantiTect Reverse Transcription kit（QIAGEN）、iQ SYBR Green master mix（Bio-Rad）、CFX96 Real Time System（Bio-Rad）。
4. Biomarker研究及发现成果解析
Biomarker定位
本研究关注血液及外周组织中的差异表达基因作为HD的潜在Biomarker，筛选逻辑遵循“微阵列筛选差异基因→GSEA富集通路→RT-qPCR验证（血液、多组织）→关联中枢病变”的闭环，确保Biomarker的“稳定性”（跨技术验证）与“相关性”（跨组织关联）。
研究过程详述
- Biomarker来源：R6/2与WT小鼠的血液、骨骼肌、皮肤、脑样本（覆盖外周与中枢组织）；
- 验证方法：结合高通量微阵列（筛选差异）与低通量RT-qPCR（验证可靠性），确保结果的重复性；
- 特异性与敏感性：血液中C3（R6/2 vs WT，上调）、Serping1（上调）、Tpm2（下调）等基因在R6/2中显著差异；骨骼肌中C3、Serping1下调具有统计学意义（p<0.05）；脑中有C3、Tpm2、Serping1的显著差异（p<0.05），表明这些基因对HD具有组织特异性。
核心成果提炼
- 外周通路失调的Biomarker候选：首次在R6/2小鼠血液中发现补体与凝血 cascade、PPAR信号通路、心肌相关通路的失调，其差异基因（如C3、Serping1）可作为HD外周Biomarker候选。例如，血液中C3上调反映HD的炎症激活状态，与人类HD患者血浆中补体蛋白升高的研究一致（Dalrymple等2007年报道）。
- 肌肉病理的Biomarker：骨骼肌中C3、Serping1显著下调（p<0.05），提示补体通路抑制可能参与HD的肌肉萎缩病理——补体系统的正常功能是清除损伤细胞，其抑制可能导致肌肉细胞碎片堆积，加重萎缩。
- 外周与中枢的关联Biomarker：血液中Serping1上调与脑内Serping1下调的反向趋势，可能反映外周与中枢的不同病理阶段：血液处于炎症激活早期（Serping1作为补体抑制剂，上调以限制炎症过度），而脑处于炎症消退或神经元损伤阶段（Serping1下调导致补体过度激活，加重神经损伤）。
- 创新性：本研究的Biomarker突破了“单一组织”的局限，通过跨组织验证（血液→肌肉→脑），证明其能反映HD的多器官病理，为HD的无创监测（如血液检测）提供了新的候选指标。例如，血液中的C3可作为反映中枢补体激活的外周标志物（脑内C3上调），而肌肉中的C3下调可提示肌肉萎缩的进展。
综上，本研究通过R6/2小鼠血液全基因表达谱分析，揭示了HD的外周通路失调，为HD生物标志物开发和治疗靶点探索提供了重要实验依据，同时验证了R6/2小鼠作为HD预临床模型的可靠性。