用高内涵成像定量 LRRK2 介导的 Rab10 磷酸化
原文：Protocol to quantify LRRK2-mediated Rab10 phosphorylation using high-content imaging
DOI：10.1016/j.xpro.2026.104819（2026-09-04 在线发表）
作者：Beatrice Masotti, Paolo Lorenzon, Giorgia Covello, Elisa Greggio（帕多瓦大学生物学系 / 威尼斯 San Camillo 医院 IRCCS）
开放获取：CC BY 4.0
DOI：10.1016/j.xpro.2026.104819（2026-09-04 在线发表）
作者：Beatrice Masotti, Paolo Lorenzon, Giorgia Covello, Elisa Greggio（帕多瓦大学生物学系 / 威尼斯 San Camillo 医院 IRCCS）
开放获取：CC BY 4.0
摘要
Rab10 第 73 位苏氨酸的磷酸化（pRab10）是激酶 LRRK2 活性的经典读出指标——LRRK2 的突变与帕金森病（PD）密切相关。本文介绍一套在原代星形胶质细胞富集培养物中、使用 Operetta CLS 高内涵成像系统对内源性 pRab10 阳性囊泡进行定量分析的完整方案，涵盖细胞培养、免疫荧光染色、图像采集，以及基于 Harmony 软件的自动化定量分析。该方案同样适用于其他表达 LRRK2 的细胞模型，可为 LRRK2 生理与病理活性的定量研究提供可放大的平台。
亮点：指导在表达 LRRK2 的细胞中检测 LRRK2 激酶活性；原代星形胶质细胞富集培养物的 pRab10 免疫染色流程；使用 Harmony 软件自动定量 pRab10 阳性囊泡的完整步骤。
背景知识
富含亮氨酸重复激酶 2（LRRK2）是帕金森病研究中的热门靶点，其致病性"功能获得性"高活性是颇具吸引力的治疗切入点。LRRK2 会磷酸化一类 Rab GTP 酶 Switch II 结构域中的高度保守位点；Rab10 是目前验证最充分的 LRRK2 底物之一。识别 Thr73 磷酸化位点的磷特异性抗体（如 MJF-R21 克隆）特异性很高，已广泛用作细胞、动物模型和人源样本中 LRRK2 激酶活性的读出指标。
LRRK2 对 Rab10 的磷酸化发生在溶酶体及其他内吞囊泡上，形成轮廓清晰的点状结构，非常适合免疫细胞化学分析。本方案使用携带 Lrrk2G2019S/G2019S 纯合敲入突变的小鼠（家族性与散发性 PD 中最常见的 LRRK2 变异）制备原代皮质星形胶质细胞富集培养物，对 pRab10 阳性囊泡、细胞核（Hoechst）和 F-肌动蛋白（phalloidin）进行免疫染色，再用 Operetta CLS 高内涵成像系统采集图像，并用 Harmony 软件自动定量囊泡。方案同样可用于野生型培养物或其他 LRRK2 突变细胞。
方法创新点：本方案的价值不在于新成像平台，而在于把"检测内源性 pRab10"这一生物学相关读出标准化、验证成可放大的中高通量工作流——培养、染色、自动多视野采集、Harmony 囊泡检测与分类四位一体，减少操作者偏差，便于在 LRRK2 抑制剂处理和溶酶体应激等不同条件间做定量比较。由于检测的是内源信号、无需过表达 LRRK2 或 Rab10，平台生理相关性强；模块化分析策略也可迁移到其他表达 LRRK2/Rab10 的模型（如 RAW 264.7 巨噬细胞、A549 细胞、iPSC 来源的巨噬细胞和小胶质细胞），只需相应优化染色与分割参数。
机构许可：小鼠的饲养与操作符合意大利国家规范，所有动物实验经帕多瓦大学伦理委员会与意大利卫生部批准（许可证 1005/2024-PR 和 D2784.N·KOC）。
开始之前：制备小鼠乳鼠原代皮质星形胶质细胞富集培养物
说明：培养物来自 Lrrk2G2019S/G2019S 纯合敲入小鼠（内源性 Lrrk2 位点携带 G2019S 替换），模型成熟、pRab10 簇信号清晰特异，可支持中高通量筛选；pRab10 阳性结构与溶酶体区室相关联，与既往报道一致。
注意：此制备并非纯化星形胶质细胞——方案基于标准新生皮质胶质细胞培养条件，利于贴壁星形胶质细胞扩增，但可能混有不同程度的小胶质细胞和少突胶质谱系细胞。若下游应用对细胞纯度要求高，建议用细胞类型特异性标记物评估培养物组成。鉴于 LRRK2 活性在星形胶质细胞和小胶质细胞等胶质细胞中均有功能表征且与病理相关，该培养物仍是研究 LRRK2 依赖性 Rab10 磷酸化的实用原代脑细胞模型；也可推广到其他脑区（如纹状体）来源的细胞。
A. 皮质解剖
- 将出生后 P0–P2 乳鼠断头取脑，从小脑向嗅球方向掀起，置于含 1% 青霉素–链霉素（P/S）的冷 DPBS 的培养皿中。
- 在解剖镜下仔细分离两侧皮质，移入另一个含冷 DPBS + 1% P/S 的新培养皿。
B. 组织解离与原代胶质细胞分离
- 在生物安全柜内操作。用移液器吸去培养皿中的 DPBS，注意不要吸走组织。
- 加入 1 mL 室温 DMEM（含 1% P/S），用 P1000 移液器轻柔吹打 10–15 次机械匀浆。
- 在 50 mL 离心管口放置 70 μm 细胞筛，将匀浆转移到筛网上；用 1 mL DMEM 冲洗培养皿并把残余组织一并转移。
- 用注射器内芯碾压组织，帮助细胞通过筛网。
- 加 1 mL DMEM 充分冲洗筛网，取走筛网后补加 22 mL DMEM 至总体积 25 mL。
- 室温 300 × g 离心 15 min，弃上清。
- 洗涤 2 次：弃上清，用 25 mL DMEM 重悬沉淀，再 300 × g 离心 15 min（室温）。
- 用 1 mL DMEM（含 1% P/S、10% FBS）重悬沉淀。
- 按 5 × 106 个细胞 / 10 mL 培养基接种到培养瓶（3 只乳鼠对应一个 T75 培养瓶），37°C、5% CO₂ 培养。
- 第 7 天完全换液，换成新鲜 DMEM + 1% P/S + 10% FBS。
- 体外培养 12–15 天（DIV）后，星形胶质细胞富集培养物达到 80% 融合，即可用于实验。
材料与设备
关键资源表
抗体
| 试剂 | 来源 | 编号 |
|---|---|---|
| Anti-RAB10 (phospho T73) MJF-R21（1:500） | Abcam | ab241060 |
| Alexa 488 山羊抗兔二抗（1:500） | Invitrogen | A11034 |
| Phalloidin-iFluor 647（1:1,000） | Abcam | ab176759 |
| Hoechst 33342（1:10,000） | Invitrogen | H3569 |
化学品
| 试剂 | 来源 | 编号 |
|---|---|---|
| DPBS | Biowest | L0615 |
| DMEM | Biowest | L0103 |
| FBS | S. I. A. L. Group | yourSIAL-FBS-SA |
| 青霉素–链霉素 | Biowest | L0022 |
| 胰酶 | Gibco | 15090046 |
| 叠氮化钠（NaN₃） | Sigma-Aldrich | S2002 |
| 多聚甲醛 16%（PFA） | Thermo Fisher | 043368-9M |
| MLi-2 | Tocris (Biotechne) | 5756 |
| LLOME | Sigma-Aldrich | L7393 |
| 二甲基亚砜（DMSO） | Carl ROTH | RTA994.2 |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | 9002931 |
实验动物
| 模型 | 来源 | 编号 |
|---|---|---|
| B6.Cg-Lrrk2tm1.1Hlme/J 小鼠（G2019S 敲入），3–6 月龄，雄性 | The Jackson Laboratory | 030961 |
| C57BL/6J 小鼠（野生型对照），3–6 月龄，雄性 | The Jackson Laboratory | 000664 |
软件与耗材
| 项目 | 来源 | 编号 |
|---|---|---|
| Harmony™ | Revvity | — |
| GraphPad Prism（v10.4.2） | GraphPad Software | RRID:SCR_002798 |
| μClear® 96 孔板（CELLSTAR®，黑壁透明底） | Greiner Bio-One | 655090 |
| Operetta CLS™ 高内涵成像系统 | Revvity | — |
试剂配方
4% PFA 固定液（分装后 −20°C 保存不超过 6 个月，用前立即融化，融化后不可反复冻融）
| 试剂 | 终浓度 | 用量 |
|---|---|---|
| PFA 16% | 4% | 10 mL |
| DPBS | — | 30 mL |
| 总计 | — | 40 mL |
透化液（现用现配）
| 试剂 | 终浓度 | 用量 |
|---|---|---|
| Triton X-100 | 0.1% | 50 μL |
| DPBS | — | 49.95 mL |
| 总计 | — | 50 mL |
封闭液（现用现配）
| 试剂 | 终浓度 | 用量 |
|---|---|---|
| FBS | 5% | 2.5 mL |
| DPBS | — | 47.5 mL |
| 总计 | — | 50 mL |
分步方案
第一部分：细胞接种与处理（约 2 天）
1. 接种细胞
当培养瓶中星形胶质细胞富集细胞达到 80% 融合时，按每孔 50,000 个细胞接种到黑壁透明底 96 孔板（带盖）。
关键：避免使用外圈孔（推荐布局见原文图 2）。原因有二：
① 仪器限制：40× 物镜因空间干涉无法可靠采集外圈孔图像；
② 边缘效应：蒸发、温度波动和湿度不均会引入细胞行为或染色强度的变异，导致数据不可靠。
外圈孔一律加满 DPBS 充当缓冲。
说明：48 h 后细胞达到融合，即可用相应化合物处理。
① 仪器限制：40× 物镜因空间干涉无法可靠采集外圈孔图像；
② 边缘效应：蒸发、温度波动和湿度不均会引入细胞行为或染色强度的变异，导致数据不可靠。
外圈孔一律加满 DPBS 充当缓冲。
说明：48 h 后细胞达到融合，即可用相应化合物处理。
2. 化合物处理
- MLi-2 处理（LRRK2 激酶抑制剂）：吸去旧培养基，换成含目标浓度 MLi-2 的新鲜 DMEM，处理 90 min。做剂量–反应曲线时，从 1 μM 起始，按 1:5 逐孔倍比稀释。
- LLOME 处理（溶酶体应激）：吸去旧培养基，换成含 MLi-2（100 nM）或 LLOME（1 mM）的新鲜 DMEM，处理 2 h。要验证 LLOME 诱导的 Rab10 磷酸化是否依赖 LRRK2，可 LLOME（1 mM）+ MLi-2（100 nM）共处理 2 h（LLOME 浓度参照 Bonet-Ponce 等的报道）。
说明：MLi-2 以 DMSO 溶解，需设置仅含等量 DMSO（与最高 MLi-2 浓度所用体积相同）的溶媒对照。
第二部分：固定与一抗染色（16–18 h：步骤 3–8 约 2 h + 过夜孵育）
- 步骤 3：吸去培养基，每孔加 100 μL 4% PFA（DPBS 配制），室温固定 20 min。
关键：沿孔壁边缘轻轻加入 PFA 以免冲散细胞；从这一步开始使用多通道移液器和试剂槽。 - 步骤 4：用多通道移液器从孔边缘小心吸去 PFA，避免细胞脱落。
- 步骤 5：DPBS 洗 5 次。第一次用多通道移液器吸除，之后加入新鲜 DPBS 后直接翻转倒掉即可。
说明：PFA 固定与洗涤须在通风橱内操作；务必彻底去除残余 PFA，以降低背景荧光。
暂停点：洗涤后，固定好的细胞可密封保存于含 0.05% NaN₃ 的 DPBS 中，4°C 最长 2 周（勿超过 2 周）。 - 步骤 6：每孔加 100 μL 透化液，室温 20 min。
- 步骤 7：每孔加 100 μL 封闭液，室温 1 h。
- 步骤 8：每孔加 40 μL 一抗工作液（anti-pRab10 MJF-R21 用封闭液 1:500 稀释），4°C 过夜（12–16 h）。
关键：步骤 7–8 期间，把孔板放在垫有湿润吸水纸的带盖聚苯乙烯盒中，保持湿度、防止样本干燥。
第三部分：二抗染色（约 2 h）
- 步骤 9：DPBS 洗 5 次。
- 步骤 10：每孔加 40 μL 二抗混合液（DPBS 稀释：山羊抗兔 Alexa Fluor 488，1:500；phalloidin Alexa Fluor 647，1:1,000），室温 1 h。从这一步开始注意避光。
- 步骤 11：DPBS 洗 5 次。
- 步骤 12：核染色：每孔加 100 μL Hoechst（1:10,000，DPBS 稀释），室温 5 min。
- 步骤 13：DPBS 洗 3 次，最后将孔板留在含 0.05% NaN₃ 的 DPBS 中。
暂停点：染色完成的细胞可密封避光保存于含 0.05% NaN₃ 的 DPBS（4°C，最长 3 周）；但建议染色后立即成像以获得最佳结果。
第四部分：Operetta CLS 图像采集（约 15 h）
14. 使用配备 40× 水浸物镜（NA 1.1）的 Operetta CLS 高内涵成像系统采集：
| 荧光通道 | 激发（nm） | 发射（nm） |
|---|---|---|
| Hoechst 33342 | 355–385 | 430–500 |
| Alexa Fluor 488（EGFP 通道） | 460–490 | 500–550 |
| Alexa Fluor 647 | 615–645 | 655–760 |
主要采集参数（Operetta CLS 实验汇总表）：96 孔 Greiner μClear 板；共聚焦模式；40× 水浸物镜；每孔 29 个视野（随机分布）；Z 堆栈 7 层；拍摄 60 孔；1 个时间点；相机 ROI 2160×2160；Binning 1。
15. 启动图像采集。
关键：正式实验前先做一次试拍，确认成像参数（如 Z 堆栈层数）适配当前细胞密度与类型；不同实验之间不要更改曝光时间或信号强度设置。
替代方案：其他具备类似能力的高内涵成像平台也可以使用，但本研究未做评估，需自行调整采集与分析参数。
说明：每孔采集 29 个视野，位置随机分布；必要时可调整视野分布（例如细胞偏集中于孔边缘时）。水浸由内置自动水循环系统维持，全程无需人工干预。
替代方案：其他具备类似能力的高内涵成像平台也可以使用，但本研究未做评估，需自行调整采集与分析参数。
说明：每孔采集 29 个视野，位置随机分布；必要时可调整视野分布（例如细胞偏集中于孔边缘时）。水浸由内置自动水循环系统维持，全程无需人工干预。
第五部分：Harmony 软件图像分析（每板约 3 h）
16. 用 Harmony 的 building block 搭建图像分析流程：
- a. 降噪：在 Alexa 647 通道使用
Filter image（Method: Smoothing，Filter: Gaussian）做高斯平滑，输出新通道"Gaussian Smoothed"用于后续模块。高斯滤波可压低高频噪声、同时保留整体荧光信号格局。 - b. 圈定细胞区域：在 Gaussian Smoothed 通道用
Find image region识别含细胞的 ROI。软件按公共像素强度阈值自动检出较亮的区域，并设最小面积阈值排除小于细胞的碎片。公共阈值默认 0.5（可调 0–1）：调低检出区域变大，调高变小，依细胞类型与实验条件优化。 - c. 计算区域属性：对识别区域使用
Calculate morphology properties和Calculate intensity properties，测量周长、面积、Alexa 647 信号强度；再用Select population圈出目标细胞群。不符合标准的区域被丢弃，入选区域以黄色边框显示。 - d. 识别细胞核：用
Find nuclei（Method B，通道 Hoechst 33342）在选定的图像区域内找核，设最小像素强度与最小面积阈值定义有效核，再计算核形态属性。Method B 在高背景图像中核识别更稳健；强度阈值 0.40、面积阈值 >30 μm² 已针对本抗体与细胞类型优化。 - e. 囊泡信号增强：在 EGFP 通道用
Filter image（Method: Sliding Parabola，curvature 4）做滑动抛物线滤波。该滤波会估计并扣除平滑连续的背景、保留点状荧光信号，把图像拆分为背景和前景两部分，输出前景作为过滤图像，显著提升囊泡结构对比度。最佳曲率取决于目标亮度和尺寸；2D 分析中可用"Tune Parameter"功能辅助确定。 - f. 检出囊泡点：用
Find image region圈出 EGFP 阳性斑点，设公共强度阈值排除接近背景的斑点；再用Find spots（Method B）定义单个斑点供后续属性计算。Method B 的检测与拆分灵敏度参数依细胞类型与斑点特征而定。 - g. 计算斑点形态属性：用
Calculate properties计算面积、圆度、周长、宽、长、宽长比（W/L）；选取 W/L > 0.2 的斑点作为输出群体。 - h. 背景扣除：用
Calculate properties计算所选群体的荧光强度，背景区域用Resize Region（外边界 −95%）定义——软件自动计算背景强度并生成"Outer Border Region"用于背景扣除。 - i. 囊泡分类：用
Calculate Properties（Method: Filter by Property）按圆度和平均信号强度双重标准筛选囊泡，两条标准均满足者保留（绿色显示），否则丢弃（红色显示）。 - j. 按面积分级：用
Select Population把囊泡分成 4 类：
| 类别 | 斑点面积 | 是否计入 pRab10 囊泡 |
|---|---|---|
| i | < 0.3 μm² | 否 |
| ii | 0.3–0.8 μm² | 是 |
| iii | 0.8–3.5 μm² | 是 |
| iv | > 3.5 μm² | 否 |
说明：类别 ii 和 iii 代表 pRab10 囊泡。
- k. 汇总统计：对每个囊泡类别使用
Calculate properties，计算囊泡数量、平均强度、总强度及形态属性。
17. 在 Harmony 中运行分析流程，结果导出为 Excel 文件。
第六部分：数据分析
18. 用 GraphPad Prism 分析：
- MLi-2 实验：用方程
log(inhibitor) vs. response -- Variable slope拟合剂量–反应曲线、计算 IC₅₀。该模型从数据中拟合 Hill 斜率而非假定标准斜率；x 轴为抑制剂浓度对数，y 轴为 pRab10 阳性囊泡数。 - LLOME 实验：数据以分组柱状图呈现；对生物学重复的均值做单因素 ANOVA + Tukey 多重比较检验。
预期结果
- MLi-2 剂量–反应：预期得到低纳摩尔级 IC₅₀（约 1–3 nM，本文实测约 3 nM）。文献报道的 MLi-2 IC₅₀：纯化 LRRK2 激酶体外试验 0.76 nM、细胞 pSer935 去磷酸化试验 1.4 nM、放射配基竞争结合试验 3.4 nM。虽然此前没有直接报道基于 pRab10 的 MLi-2 IC₅₀，但 LRRK2 抑制与 Rab10 磷酸化下降的强相关性已在包括小鼠原代星形胶质细胞在内的多种细胞中被充分验证，因此本方案测得的 IC₅₀ 可与既往数值直接比较。随 MLi-2 浓度升高，pRab10 阳性囊泡应呈渐进性减少（各浓度间每孔细胞核数保持一致，证明无细胞数量混淆因素）。
- LLOME 溶酶体应激：LLOME（1 mM）处理应显著增加 pRab10 阳性囊泡数量；共处理 MLi-2（100 nM）可拯救（回落），与 HEK 细胞和 MEF 中的既往报道一致，证明该响应确实依赖 LRRK2 激酶活性。
局限性
- 方案针对 Operetta CLS 系统优化；其他高内涵平台未经过测试，需自行调整采集与分析参数。
- 方案基于携带内源性 Lrrk2G2019S 的小鼠原代皮质星形胶质细胞富集培养物开发；迁移到其他脑区来源的星形胶质细胞或其他细胞类型时，细胞产量、形态和基线 LRRK2 活性的差异可能要求重新优化接种密度、抗体选择（如替代结构标记物）和成像参数（如 pRab10 信号强度）。
- 培养物未经星形胶质细胞纯化，星形胶质细胞与混杂胶质细胞的比例在不同制备间可能波动（尤其受小胶质细胞去除步骤效率的影响）。对纯度要求高的应用，应加入并验证额外的标准化去除/富集步骤（如免疫淘选、流式分选或氯膦酸盐清除小胶质细胞）。
- 方案的模块化设计便于跨实验体系迁移：各步骤与基线参数可作为系统化优化的起点。
Troubleshooting
| 问题 | 可能原因 | 解决方案 |
|---|---|---|
| 细胞活性低或形态异常（步骤 1） | 原代培养物传代次数过多，导致形态改变（如细胞拉长）或其他胶质亚群过度生长 | 只用早代细胞——P1 代接种，最迟不超过 P2 代 |
| 孔间细胞分布不均（步骤 1） | μClear 96 孔板孔底略呈凸面（曲率约 200 μm），接种时细胞容易向孔中心聚集 | 接种前充分混匀细胞悬液；接种后室温静置约 10 min 让细胞均匀分布，再放入培养箱 |
| 免疫染色后细胞形态异常（边缘翘起或褶皱） | 洗涤步骤过于剧烈引起部分细胞脱落（步骤 3–5） | 轻柔洗涤——沿孔壁缓慢加液和吸液，避免直接冲击细胞层，尽量减小吸液力度 |
| 背景信号过高 | ① 抗体孵育步骤间洗涤不充分（步骤 9–11）；② 一抗或二抗溶液中有聚集体（步骤 8、10） | ① 增加洗涤次数或时长；② 抗体使用前短暂离心去除聚集体；③ 必要时优化抗体浓度以减少非特异染色 |
资源与联系
- 通讯作者（资源请求）：Elisa Greggio（elisa.greggio@unipd.it）
- 技术联系人（实验执行问题）：Beatrice Masotti（beatrice.masotti@unipd.it）、Paolo Lorenzon（paolo.lorenzon.1@unipd.it）
- 材料可用性：本研究未产生新的独特材料；未生成/分析新数据集或代码。
- 致谢：Michael J Fox Foundation for Parkinson Research（023427、022431）；欧盟 NextGenerationEU（PRIN 20222LRHCW）；帕多瓦大学生物学系显微成像核心设施。