小鼠皮肤精切薄片（PCSS）的制备、活性评估与下游处理

摘要

精切组织薄片（Precision-cut tissue slices, PCTS）是一种保持器官活性的离体切片模型，广泛用于治疗筛选、毒性评估和感染建模。但皮肤因生物力学特性（弹性、抗剪切性）特殊，长期以来无法用常规 PCTS 流程切片。

本 Protocol 系统给出了小鼠精切皮肤薄片（Precision-cut Skin Slices, PCSS）的完整流程，覆盖四大模块：

1. 制备：皮肤修整 + 泡沫垫「三明治」固定 + 8% 低熔点琼脂糖包埋 + Compresstome™ 振动切片（500 μm 厚、1 cm 长）；
2. 培养维持：24 孔板培养，最长可维持 6 天；
3. 活性监测：培养上清 LDH 释放检测（非破坏性）+ 匀浆 ATP 定量（荧光素酶法）；
4. 下游处理：TRIzol™ 一管法 RNA/蛋白联合提取、酶解解离与细胞计数、常规 HE 组织学与 TUNEL 凋亡检测。

核心亮点：① 克服皮肤力学难题的完整包埋与切片步骤；② LDH + ATP 双指标随时间评估活力；③ 针对角蛋白/胶原丰富组织优化的 RNA/蛋白联合提取；④ HE 与 TUNEL 验证组织结构与死亡定位。

创新点：皮肤此前因力学特性无法精切。本方案对标准 PCTS 流程做了多项革新——泡沫垫三明治 + 定向粘接 + 预温琼脂糖均匀包埋；同时改进了 TRIzol 联合提取、酶解解离与组织切片制备等常规流程。

实验前须知（Before you begin）

• 模型背景：目前皮肤模型的核心矛盾是复杂度 vs 成本/标准化/可重复性——重建表皮、经典器官型培养便宜可重复但保真度有限；iPSC 衍生细胞、3D 生物打印、微流控保真度高但贵且难标准化。PCSS 填补中间地带：简单、可活、器官型、兼容多种下游应用。
• 动物：本方案用 8–15 周龄雌性 BALB/c 小鼠剃毛背部皮肤。饲养、操作与安乐死必须符合国家及所在机构的动物福利规范。
• 取样后立即处理，不要储存。

实验前准备：培养基与溶液（Timing: 1–2 h）

• 两块 24 孔板每孔加 500 μL DMEM + 补充剂（20% FBS），37°C、5% CO₂ 湿化孵箱平衡；
• 备 50 mL 37°C 预温 PBS 与 250 mL 4°C 冷 PBS；
• 微波炉融化 8% 低熔点琼脂糖（PBS 配）至轻沸，42°C 保温；转移吸头与样本夹金属嵌件预温 42°C；−20°C 冷却块提前预冷；
• 配 TE 缓冲液；珠磨管装 4 颗 2.8 mm 氧化锆珠 + 500 μL TE（ATP 用）；另备珠磨管 + 800 μL TRIzol™（RNA/蛋白用）；
• 现配 7 M 盐酸胍（6.687 g 溶于 10 mL ddH₂O）与重溶缓冲液（勿储存）；配胶原酶/Dispase 消化液（4°C 可存 1 周）。

关键材料清单（Key resources table）

主要试剂

主要设备

Compresstome™ VF-300OZ 振动切片机（Precisionary）、Fisherbrand™ Bead Mill 24 匀质器、FLUOstar Omega™ 酶标仪（BMG Labtech）、LUNA-FX7™ 荧光细胞计数仪（Logos Biosystems）、Leica Dmi 8 显微镜、Leica HistoCore Multicut 切片机 / Arcadia C 包埋系统、Logos One 脱水机、HERAcell 150 CO₂ 孵箱（Thermo）、70 μm 细胞滤网（Corning）、Superfrost™ 及 Superfrost™ Plus Adhesion 载玻片（Epredia）等。

试剂配方表

① DMEM + 补充剂（500 mL，4°C 可存 3 个月）——制片当天用 20% FBS，维持期换 10% FBS。

② TE 缓冲液（100 mL，4°C 可存 3 个月；可配 10× 储液 4°C 存 1 年）

③ 蛋白重溶缓冲液（2 mL，现配现用，尿素不稳定勿储存）

④ 胶原酶/Dispase 消化液（4 mL，4°C 可存 1 周；可配 10× −20°C 存 1 年）

⑤ Compresstome™ 切片参数

⑥ Bead Mill 24 匀质参数：速度 4 m/s、4 个循环、每循环 40 s、间歇 60 s。

分步方案（Step-by-step method details）

步骤 1｜皮肤样本制备与琼脂糖包埋（Timing: 30 min）

皮肤力学特性使切片困难，本步是 PCSS 成败关键（见 Troubleshooting 1，原文图 1 展示全流程）。

1. 皮肤平铺培养皿，手术刀 + 剪刀去除筋膜、脂肪、毛发等多余解剖结构，过厚/过弹的皮下层建议切除；
2. 切成不超过 12 × 22 mm 的矩形；
3. 泡沫垫三明治：两片组织学泡沫垫裁至与皮肤同尺寸（≤12 × 22 mm）→ 真皮面朝下平铺展开、边缘摊平 → 第二片盖在表皮面轻压成紧凑三明治。关键皮肤必须尽可能平整、不扭转；
4. 粘接：培养皿滴一滴氰基丙烯酸酯液体胶 → 平头镊夹三明治一端蘸胶 → 粘到样本夹活塞底座，等数秒固化；
5. 琼脂糖包埋：活塞插入 42°C 预温金属嵌件 → 预温吸头快速取 42°C 琼脂糖，均匀分布到三明治与嵌件之间 → 缓慢升起嵌件至完全包埋。关键琼脂糖必须均匀（否则推而不切）；
6. −20°C 冷却块 1 min 30 s 表面固化 → 4°C 存 15 min 后进入下一步。

步骤 2｜PCSS 切片生成与培养维持（Timing: 6 h）

1. 准备 Compresstome™：开机，取下收集托盘，完全旋出千分尺螺丝 → 冷样本夹放入转移槽拧紧 → 槽内加 4°C 冷 PBS 没过样本夹 → 半片超薄刀片装上磁性刀架拧紧 → 旋转活塞使三明治垂直于刀轴；
2. 千分尺螺丝拧至接触活塞；按参数表设置（厚度 500 μm、速度 4–6、振荡 4）；
3. 千分尺进一整圈（= 500 μm），按「Start」切片；
4. 检查收集盘圆盘：只有琼脂糖/泡沫 → 弃；含组织 → 转入 37°C PBS 培养皿，两把平头镊分开泡沫垫游离 PCSS，转入已加 500 μL DMEM + 20% FBS 的 24 孔板；
5. 重复上一步直到皮肤用尽（泡沫垫出现胶水即取材结束）；
6. 24 孔板放入 37°C、5% CO₂ 湿化孵箱；
7. 换液：小心吸走培养基 → 每孔 500 μL 37°C PBS 洗 → 换 500 μL 37°C 预温 DMEM + 10% FBS（维持期每天换液）。

提示全程无菌轻柔：PCSS 会粘吸头/孔壁（Troubleshooting 3）；切片渐难时换新鲜 4°C PBS（Troubleshooting 1）。切片过程见原文 Methods Video S1。

步骤 3｜培养上清 LDH 检测（Timing: 1 h）

LDH 是普遍存在的胞内酶，上清中升高提示细胞应激与死亡。该法简单、不破坏样本，可随时间动态监测 PCSS 损伤。

1. 收集拟测 LDH 孔的培养基；
2. 阳性对照：配 20% Triton X-100（50 μL Triton + 200 μL 培养基），对照孔加 50 μL（终浓度 2%），孵 10 min；
3. 每孔培养基收至单独 EP 管，弃 2 片 Triton 处理的 PCSS；
4. 500 × g 离心，冰上小心取上清入新管（避开脂质层与碎片沉淀）。暂停点样本可暂存后再测；
5. 冻干染料 1 mL ddH₂O 重溶；96 孔板每孔 100 μL 上清，双复孔；
6. 反应混合物现配（每 100 测试 = 250 μL 染料 + 11.25 mL 催化剂），每孔 100 μL，避光孵 10 min；
7. 酶标仪 490 nm 读数（FLUOstar Omega™ 或同类）。

步骤 4｜PCSS 匀浆 ATP 定量（TE 缓冲液，Timing: 1 h）

ATP 是代谢与活力的直接指标，荧光素酶生物发光法直接在 PCSS 上测，用于交叉验证 LDH 结果。

1. 收集拟测 ATP 的 PCSS，37°C PBS 洗孔；
2. 单片 PCSS + 500 μL TE 缓冲液转入预装 4 颗 2.8 mm 氧化锆珠的珠磨管；
3. Bead Mill 24 匀质（参数见配方表⑥）；匀质器 20°C 孵 5 min 后再匀质一次；
4. 1,000 × g 离心，冰上小心取 TE 匀浆（避开脂质层与沉淀）。暂停点匀浆可暂存；
5. 荧光素酶试剂 10 mL ddH₂O 重溶、按需稀释；用试剂盒 ATP 标准品制备系列标准稀释液（拟合 4PL 标准曲线）；
6. 96 孔板每孔 50 μL TE 匀浆，双复孔；
7. 每孔 50 μL 荧光素酶试剂，立即测发光（关键发光信号随时间衰减）。

步骤 5｜TRIzol™ RNA/蛋白联合提取与定量（Timing: 7 h）

单片 PCSS 提 RNA，两片合并提蛋白。RNA 兼容多种下游应用；蛋白为变性蛋白，仅限 Western blot、质谱等，不兼容需天然构象的方法（如 ELISA）。TRIzol™ 为危险试剂，须按机构规范防护。

1. 收集 PCSS，37°C PBS 洗孔；
2. 单片 PCSS + 750 μL TRIzol™ 入预装珠子的珠磨管，Bead Mill 匀质，匀质器 20°C 孵 5 min 后再匀质一次。暂停点TRIzol 匀浆可 −80°C 存放；
3. 相分离：−70°C 30 min → 60°C 5 min → 冰上 5 min → 转 2 mL EP 管 → 加 150 μL 氯仿（可用毒性更低的 1-溴-3-氯丙烷替代）→ 涡旋 10 s、20°C 3 min → 12,000 × g、4°C 离心 15 min；
4. 上层水相（RNA）转入新管做 RNA 纯化；弃白色中间相；下层有机相（蛋白）转入新管做蛋白沉淀（暂停点4°C 可存 24 h 或冰上短存）；
5. RNA 柱纯化（每次离心后换收集管）：水相 + 350 μL 70% 乙醇 → Macherey-Nagel 蓝柱 11,000 × g、4°C 离心 → 350 μL MDB 过柱 → DNase 重溶（550 μL 无 RNase 水，1:10 稀于反应缓冲液）→ 95 μL 1:10 DNase 柱上消化 15 min（20°C）→ 200 μL RAW2 → 600 μL RA3 → 250 μL RA3 → 转 1.5 mL 收集管，40 μL 无 RNase 水洗脱；
6. NanoDrop™（DeNovix DS-11 或同类）定量 RNA；
7. 蛋白沉淀与洗涤：有机相 + 300 μL 100% 乙醇（沉 DNA）→ 冰上 3 min → 2,000 × g 5 min → 上清转新管（避开 DNA 沉淀）→ +1.5 mL 异丙醇 → −80°C 60 min → 12,000 × g 10 min → 吸上清、倒扣干燥 5 min → 100 μL 7 M GndCl 重悬 10 min → 两片蛋白合并为 200 μL → +1.8 mL 乙醇涡旋 10 s → −80°C 60 min → 12,000 × g 5 min → 吸上清。关键沉淀仍发红（残酚）则 200 μL GndCl 重悬后重复乙醇洗涤；再 2 mL 乙醇涡旋—振荡—涡旋、12,000 × g 10 min → 干燥 5 min → 100 μL 重溶缓冲液涡旋—振荡—涡旋后收集（困难见 Troubleshooting 4；暂停点−20°C 1 周 / −80°C 长期）；
8. Pierce™ BCA 标准流程定量（建议 1:5 稀释双复孔落入线性范围）；
9. 酶标仪 562 nm 读数。

步骤 6｜PCSS 解离与细胞计数

胶原酶/Dispase 消化获得细胞悬液，AO/PI 染色直接计数并评估死亡比例。

1. 收集拟解离的 PCSS，37°C PBS 洗孔；
2. 转入培养皿，手术刀切成约 2 mm 小块；
3. 4 mL 1× 胶原酶/Dispase 消化液，37°C 水浴过夜（约 16 h）；建议两片合并消化以获得足够细胞；
4. 加 1 mL FBS 终止消化；
5. 吹打匀质，经预润湿的 70 μm 滤网过滤（少量真皮胶原团块残留属正常）；
6. 500 × g、20°C 离心 5 min，弃上清；1 mL DMEM + 10% FBS 重悬；
7. 18 μL 细胞悬液 + 2 μL AO/PI 混匀；
8. 取 10 μL 上计数板，LUNA-FX7™（或同类）计数并评估活力（异常低见 Troubleshooting 5）。

步骤 7｜常规组织学分析（Timing: 3 天）

评估组织完整性、确认培养中 PCSS 整体结构保存。涉及二甲苯、异丙醇、PFA、酸性染料等危险化学品，须通风橱内按机构规范操作。

1. 固定：单片 PCSS 夹入两片泡沫垫（关键尽量平铺、表皮朝上真皮朝下、不扭转——决定包埋方向成败，见 Troubleshooting 6），装入组织学盒浸入 4% 中性缓冲 PFA（通风橱）。暂停点4°C 最多 24 h；超过则换 PBS 防过度固定；
2. 脱水与浸蜡：梯度乙醇逐级脱水 → 二甲苯透明 → 熔蜡浸润（手工或 Logos One™ 类自动脱水机）；
3. 包埋：56°C 保温开盒弃泡沫垫 → 金属模底注热蜡 → PCSS 平放模底 → −14°C 冷台固化 → 补满热蜡、盖盒底 → 冷台固化 ≥30 min → 脱模修块。关键方向取决于步骤 7.1——表皮真皮需在块面底部清晰可辨。石蜡块室温可长期保存；
4. 切片：Superfrost™ 载玻片涂薄层 ddH₂O；石蜡块冷至 −14°C，20 μm 修片至 PCSS 全表面露出 → 改切 4 μm 上片（TUNEL 用 Superfrost™ Plus Adhesion 粘附片）→ 37°C 热台数分钟、沥干；
5. 载玻片竖放 37°C 烘箱 24 h（TUNEL 48 h）；
6. 复水后按标准流程做 HE 染色；
7. 脱水后 Eukitt® 快固封片剂封片（暂停点干燥染色片可长期保存）；
8. Leica Dmi 8™（或同类）镜检。

步骤 8｜TUNEL 凋亡检测（Timing: 3 h）

TUNEL 通过标记凋亡/坏死产生的双链 DNA 断裂，定位 PCSS 内的局部/特异性死亡。必须使用步骤 7.4 制备的粘附载玻片。

1. 切片按步骤 7.6 复水；
2. 透化：吸干、疏水笔画圈；1× Proteinase K（100× 储液 1:100 PBS 稀释）每片 50 μL，37°C 20 min；
3. 对照制备（对照小鼠皮肤切片）：1× DNase I 缓冲液 = 10× 按 1:10 稀释；DNase I 配 200 U/mL（关键勿涡旋，会毁酶）；阳性对照：50 μL 缓冲液 5 min → 50 μL DNase I → 37°C 30 min → PBS 3 次 × 5 min；阴性对照：同流程不加酶；
4. TUNEL 标记（避光）：每片/阳性对照 = 35 μL TdT 平衡缓冲液 + 10 μL 标记液 + 5 μL TdT 酶；阴性对照 = 40 μL 平衡缓冲液 + 10 μL 标记液（无酶）；每片先加 50 μL TdT 平衡缓冲液 37°C 30 min → 吸干 → 加 50 μL 对应标记液 → 37°C 避光湿盒 60 min → PBS 避光洗 3 次 × 5 min；
5. DAPI 复染核：20°C 避光 5 min → PBS 避光洗 3 次 × 5 min；
6. 抗荧光淬灭封片剂封片、去气泡（暂停点4°C 避光可存 1 周内镜检）；
7. 荧光显微镜观察（DAPI：Ex 350/Em 470 nm；TRITC 红：Ex 590/Em 617 nm）。

预期结果

• ATP 曲线：前 2 天能量代谢明显下降（切片创伤），随后稳定至第 7 天，第 8 天显著骤降；
• LDH 曲线：前 2 天显著升高（组织应激），第 3 天起下降并稳定，第 8 天有不显著的上升趋势；
• LDH 与 ATP 显著负相关（Spearman r = −0.76，p = 0.03）——仅靠上清 LDH 即可无创动态监测 PCSS 活力，不必牺牲样本；
• 产出量：10 × 20 × 0.5 mm 的 PCSS 兼容全部下游操作——单片足够 RNA（均值 52.8 ± 4.0 ng/μL，40 μL 体系）；两片合并蛋白（均值 1,727 ± 105.6 μg/mL，100 μL）；两片合并解离平均 226,000 个细胞（每片 9–12.9 万），活力 83–89%；
• 组织学：皮肤结构保持良好；第 6 天起渐进性表皮脱屑（角质形成细胞选择性死亡）与整体结构松散；
• TUNEL：第 1 天毛囊处局部死亡（切片 + 脱毛所致）；第 6 天起表皮层边缘死亡；
• 结论：PCSS 活力保持至第 6 天，兼容 qRT-PCR、Western blot、流式、组织学与 TUNEL 等多种分析。

定量与统计分析

• ATP 用 4PL（四参数）标准曲线换算；LDH 与 ATP 以 mean ± SEM 表示；
• 逐日比较用普通单因素 ANOVA；LDH-ATP 相关性用 Spearman 检验；
• 分析作图用 GraphPad Prism 10.1.1；显著性阈值 p < 0.05。

局限性

1. 物种与品系：仅用近交系 BALB/c 小鼠新鲜皮肤验证；不同遗传背景、非新鲜组织的可重复性未评估；人 PCSS 文献另有方案（更小活检、更薄真皮层，来自皮肤纤维化患者），不能直接套用；
2. 产出规模：一块 20 × 10 mm 皮肤约产 40 片；同一皮肤首末切片可能有差异（本研究未观察到）；>40 片需多个样本夹，可能引入夹间差异；
3. 培养时长：当前条件最多维持 6 天的组织结构、细胞多样性与能量代谢；更长培养须改良条件。

Troubleshooting