在 Jurkat T-ALL 细胞中利用 CRISPR-Cas9 介导的同源定向修复（HDR）建立内源性基因敲入

摘要

Jurkat 细胞是生物学多个领域广泛使用的细胞系模型，源自一位 14 岁 T 细胞急性淋巴细胞白血病（T-ALL）患者，保留了疾病中的多数关键突变（包括经典的 TAL1 增强子功能获得突变），是研究 T-ALL 的忠实模型。

本 Protocol 利用 CRISPR-Cas9 介导的同源定向修复（HDR），在 Jurkat 细胞的内源性位点敲入外源 DNA 序列（knock-in），覆盖两大应用：

1. 大片段敲入：在癌基因（示例为 TAL1）N 端精准插入约 700 bp 的 GFP 荧光标签，构建内源性荧光报告细胞系；
2. 精准点编辑：在已标记癌基因的非编码调控区引入单碱基级精准突变（示例为破坏 GATA3 结合位点），研究顺式调控机制。

应用方向涵盖基因调控研究、肿瘤生物学、HIV 研究与 T 细胞信号通路等。

核心亮点：① 用 CRISPR-Cas9-HDR 构建 GFP-癌基因融合蛋白的完整步骤；② 在非编码调控序列内引入精准编辑的方法；③ 从试剂设计、载体构建到递送筛选的全流程指导。

创新点：在悬浮细胞系（尤其是非编码区）实现高效 CRISPR-HDR 一直很有难度。本方案优化了大片段标签（~700 bp）的内源敲入流程，并配套给出在已标记癌基因调控区做单碱基替换的策略，可在多种细胞模型中推广。

实验前须知（Before you begin）

• CRISPR 技术出现之前，研究基因表达主要靠外源过表达报告基因融合蛋白，容易产生假象，无法真实反映内源性基因调控。内源敲入让蛋白在自身启动子控制下表达，生理相关性更强。
• HDR 效率受同源臂长度影响很大，是设计供体模板时的关键决定因素。
• 本方案中 DsRed 标记位于同源臂之外，仅用于监测转染效率——成功重组的细胞会丢失 DsRed（质粒骨架不整合），因此可用「GFP 阳性 / DsRed 阴性」双门筛选富集正确编辑的克隆。
• 本方案可推广到其他目的基因位点，用于研究恶性肿瘤中的基因调控问题。

关键材料清单

试剂与耗材

配方表 ①：crRNA 寡核苷酸磷酸化与退火

配方表 ②：sgRNA 双链与载体连接反应

连接反应 20–25°C 孵育 2 h，随后 65°C 加热失活 15 min。

配方表 ③：PCR 反应体系（25 μl，冰上配制）

配方表 ④：PCR 循环程序

分步方案（Step-by-step method details）

Part 1：设计 GFP 敲入的 HDR 供体质粒模板

HDR 供体模板含 GFP 序列，两侧为各约 1500 bp 的同源臂（与目的基因同源）。DsRed 位于 CMV 启动子下游、同源臂之外，用于监测转染效率并排除未重组细胞。供体质粒通过商业 DNA 合成服务获得。

1. 选择可容纳大片段的哺乳动物载体骨架（如 pUC57-kan）。
2. 用 Benchling（或 CHOPCHOP）导入目的基因 DNA 序列（Ensembl / NCBI 数据库已内嵌）。
   • 找到目的基因第一个编码外显子，高亮起始密码子 ATG。
   • 关键N 端插入时，GFP 序列插入在第一个编码外显子上游、紧接 ATG 之后，保持读码框。
   • 在 Benchling 中选取同源臂序列。示例中 TAL1 的左同源臂对应外显子 3 的 5′ 区，右同源臂对应外显子 3；左臂位于 GFP 上游，右臂位于 GFP 下游。
   • 关键同源臂长度是 HDR 效率的决定性因素；大片段插入建议 ≥1500 bp。
3. 在供体模板 CMV 启动子下游引入 DsRed 荧光基因，用于监测转染。
4. 在 DsRed 下游引入 Poly(A) 信号序列。
5. 导入 GFP DNA 序列，并将其置于 PolyA 信号下游。
6. 通过商业 DNA 合成服务生成供体质粒。
7. 用顺手的 CRISPR 设计工具设计 sgRNA（如 Benchling 的 CRISPR 功能）。关键在供体同源臂中引入阻断突变（blocking mutations）（示例：ACC>ACA，Thr；CGG>CGA，Arg），避免成功插入后 Cas9 再次识别并切割。

Part 2：sgRNA 克隆入 Cas9 表达载体、细菌转化与质粒扩增

1. 订购含 sgRNA 序列的 DNA 寡核苷酸，加上与线性化载体匹配的粘性末端。注pX330 系统接头为 5′-CACC[正义链]-3′ 和 5′-AAAC[反义链]-3′；若靶序列不以 G 开头，在 sgRNA 5′ 端补一个 G 以满足 U6 启动子要求。寡核苷酸用水或 1× TE 复溶至 100 μM。
2. 寡核苷酸磷酸化并退火（配方表 ①），之后 1:200 稀释。
3. 酶切载体并连接：用 BbsI 酶切 5–10 μg pX330 载体（20 μl 体系）→ 加 1 μl CIP（NEB）防自连 → 37°C 15 min → 65°C 15 min 失活 → 胶回收 → 按配方表 ② 连接（20–25°C 2 h，65°C 15 min 失活）。
4. 取 2 μl 连接产物热激转化 20 μl Stbl3 感受态细胞。
5. 37°C、200 rpm 摇菌复苏 1 h，取 100 μl 涂含抗生素的 LB 平板，37°C 培养 12–16 h。
6. 挑至少 3 个单克隆接入 4–5 ml 含抗生素 LB，37°C、200 rpm 培养 12–16 h；取 1 ml 菌液小提质粒、测序确认插入正确。
7. 扩培后用无内毒素中提试剂盒制备质粒，测定浓度。

Part 3：细胞准备与 CRISPR 组分核转染

1. 质粒与核转染试剂冰上融化；准备 12 孔板，每孔 1 ml RPMI 完全培养基。
2. 供体质粒与 pX330-sgRNA 质粒等比例混合。
3. 收集 2×10⁶ 个细胞：500 g 离心 5 min，弃上清，用 20–25°C PBS 轻柔洗涤细胞团 2 次。
4. 核转染：细胞轻柔重悬于 100 μl Ingenio 电转液，加入质粒混合物，转入 0.2 mm 电转杯，Amaxa D-23 程序电转。
   • 注D-23 是 Jurkat 的高效转染程序；换细胞系需重新摸程序，可用 1 μg pMax-GFP 单独试转、流式评估。
   • 关键电转结束后立即向电转杯中加入从 12 孔板吸出的温热培养基。
   • 将细胞悬液转移回 12 孔板，避开「泡沫状」细胞碎片；放入 37°C / 5% CO₂ 培养箱。

Part 4：FACS 分选与 GFP 敲入细胞扩增

1. 核转后恢复约 3 天，离心去上清，细胞重悬于 FACS 缓冲液（PBS + 2% FBS，4°C 可存 1 周），加活性染料 Hoechst 33258（1:5000）。
2. 流式分析，选好检测 GFP 与 DsRed 的激光通道。注DsRed 阳性提示无效或脱靶重组，分选时应排除。
3. 先门出活细胞，再门出 GFP 阳性 / DsRed 阴性群体，直接分选进预加 200 μl RPMI 完全培养基的 96 孔板。注避开板边缘孔（蒸发），板用锡纸松包防蒸发；37°C / 5% CO₂ 培养 3–4 周。
4. 克隆扩增后，流式复验 GFP 表达。
5. 用 DNA 提取试剂盒从扩增克隆提取 gDNA。
6. PCR + Sanger 测序验证荧光标签成功插入且标签与内源蛋白均无突变。
7. 扩增携带 GFP-癌基因融合的正确克隆。

Part 5：GFP 敲入细胞系的功能验证

以靶向 TAL1 非编码区 MYB 结合基序为例，用 CRISPR-Cas9 RNP 策略瞬时敲除已知调控序列，观察 GFP 报告信号变化：

1. 用 Benchling 选择靶向融合基因已知调控序列的 sgRNA，另选靶向安全港位点 AAVS1 的对照 sgRNA。
2. 订购 crRNA 及带荧光标记（如 ATTO 550）的 tracrRNA，用于监测转染效率；crRNA / tracrRNA 复溶至 200 μM。关键全程置于冰上防降解。
3. RNP 复合物配制：分别准备靶向目的位点（MYB）与对照位点（AAVS1）两组；crRNA : tracrRNA 按 1:1（各 5 μl）混合，95°C 5 min，自然冷却至 15–25°C（sgRNA 双链 −20°C 可存 1 年）；取 3.9 μl sgRNA + 5.1 μl Cas9 蛋白（10 mg/ml）+ 6 μl PBS，室温 20 min 形成 RNP。
4. 收集 2×10⁶ 细胞 / 条件，500 g 5 min，室温 PBS 洗 2 次；100 μl 电转液重悬，加 10 μl RNP，0.2 mm 电转杯，Amaxa D-23 程序电转（有条件可用 Neon 电转系统）。
5. 立即加温热培养基、转回 12 孔板、避开碎片，37°C / 5% CO₂ 培养。
6. 转染后 24 h 或 48 h 流式分析（瞬时转染 48–72 h 信号最强）。可用 TIDER 等工具基于 Sanger 测序评估编辑效率。与对照组相比 GFP 表达下降，即提示该调控序列对癌基因有正向调控作用。

Part 6：用 CRISPR-Cas9-HDR 精准编辑 GFP-癌基因的调控区

以破坏 TAL1 增强子上 GATA3 结合位点（5′-GATA-3′）为例：

1. 设计 sgRNA 与 ssODN：基因位点序列导入 Benchling，设计高效且离编辑位点最近的 sgRNA——关键sgRNA 越靠近编辑位点，HDR 效率越高；选择约 100 bp、覆盖编辑位点的单链寡核苷酸供体（ssODN）；订购 crRNA、tracrRNA 和 ssODN。关键tracrRNA 的荧光标记需与亲本细胞系的报告基因（GFP）不同色，否则无法区分。
2. 配制 sgRNA 与 ssODN：试剂按厂商说明复溶；crRNA : tracrRNA 1:1（各 5 μl）混合，95°C 5 min，冷却至 15–25°C。
3. 配制 RNP：每次电转 = sgRNA 3.9 μl + Cas9 5.1 μl + PBS 6 μl，室温 20 min。
4. 核转染（Amaxa D-23）：RNP 孵育期间收集 2×10⁶ 细胞 / 条件，500 g 5 min，室温 PBS 洗 2 次，弃 PBS；每条件用 100 μl 电转液重悬，加入 10 μl RNP 和 3 μl 100 μM ssODN。
5. 核转后 24 h 进行单细胞分选：500 g 离心 5 min；FACS 缓冲液重悬 + Hoechst 33258（1:5000）；选取 ATTO550 阳性信号最强的前 5% 细胞；分选进含 200 μl RPMI 完全培养基的 96 孔板。
6. 单克隆扩增：标准条件培养 2–3 周（或直至可见细胞沉淀）；标记各克隆，取约 50 μl 悬液留样，其余转入 24 孔板扩增；用 QuickExtract 提取各克隆 gDNA。
7. PCR + Sanger 测序基因分型：设计 PCR 策略使编辑位点位于扩增子中间；先用亲本细胞 gDNA 优化 PCR；Phusion 高保真酶扩增（配方表 ③④，25 μl 体系）；取 5 μl 跑 2% 琼脂糖凝胶、100–110 V；剩余产物 4°C 存 12–16 h（更久则 −20°C）；记录单一条带的克隆（多条带提示多位点切割）；单带克隆 PCR 产物纯化后 Sanger 测序确认编辑。
8. 将携带目标 indel 的克隆转入 12 孔板扩增。

sgRNA 与 ssODN 序列参考（原文 Table 1）

预期结果（Expected outcomes）

• GFP 内源敲入完成后，报告信号直接反映内源性 TAL1 的表达水平；
• 用 RNP 策略敲除 MYB 结合位点等调控元件后，可观察到 GFP 报告信号的变化，在生理情境下验证顺式调控元件的功能；
• 单碱基级 ssODN 编辑可破坏 GATA3 等转录因子结合位点，Sanger 测序确认编辑；
• 所有 GFP 敲入克隆均需经过 PCR + Sanger 验证后方可使用。

局限性（Limitations）

• 本方案未判定敲入是杂合还是纯合；在作者的场景中不影响结论（敲入发生在增强子调控的 TAL1 位点），但其他应用需自行评估。
• 敲入效率约为每 60–70 个单克隆中 1 个。由于分选时全部细胞均为 ATTO 550 阳性（tracrRNA 带标记），ATTO 550 阳性 ≠ 编辑成功，必须测序确认。
• Cas9 依赖 sgRNA 识别 PAM 位点切割，目的区域 PAM 位点数量可能限制该技术的适用范围。
• DNA 修复通路缺陷的细胞系对 CRISPR-Cas9 抗性较强：作者在 416 B 细胞系上多次尝试 HDR 敲入，筛选数百个克隆后成功率仍然很低。细胞倍性状态也会影响编辑效率。

问题排除（Troubleshooting）

资源获取

• Lead contact：Marc R. Mansour（m.mansour@ucl.ac.uk）
• Technical contact：Joana R. Costa（joana.rodrigues-simoes-da-costa@lsbu.ac.uk）
• 本研究生成的全部质粒与细胞系可向 lead contact 索取；未生成新的代码。