STAR PROTOCOLS · 每日一篇 · 第 006 期
从肿瘤引流淋巴结"榨"出组织液：低速离心 + 蛋白组学
背景与原理
肿瘤持续释放可溶性因子，随组织液引流至肿瘤引流淋巴结（TDLN），在转移发生之前就启动淋巴结重塑。想弄清"肿瘤到底往淋巴结寄了什么"，难点在于：胞外蛋白只占组织总蛋白的一小部分，常规全组织裂解会把大量胞内蛋白混进来，信噪比很差。
本 Protocol 的核心是低速离心分离组织液（ISF）：把完整组织放在 20 μm 滤网上，150 × g 离心 10 分钟，胞外液体被"挤"出来收集在管底，而组织保持完整、细胞保持存活——同一份组织之后还能继续做流式、免疫荧光甚至单细胞测序，实现胞外蛋白组与细胞读出的配对分析。
原文针对 BALB/c 小鼠第 4 乳腺脂肪垫原位注射 4T1（转移性）与 67NR（非转移性）乳腺癌细胞的双侧模型做了标准化，覆盖细胞制备、原位接种、取材、ISF 分离、质谱样品制备和下游生信分析的全流程。
创新点
- 把原本用于实体瘤代谢组学的低速离心 ISF 分离法，迁移到淋巴结——尤其是转移前阶段的 TDLN，整合为"分离-存活-组学"一体化工作流。
- 离心条件经过优化：细胞活力不变、组织结构完整（免疫荧光证实），剩余组织可继续用于流式、scRNA-seq 等，一份样本出两类数据。
- 可推广：适用于感染等其他疾病情境，可改造用于患者来源淋巴结样本，也可换成代谢组学读出。
实验前准备（Before you begin）
机构许可与动物
- 动物实验需事先获得伦理审批（原文：德国拜仁州 Regierung von Unterfranken，许可证号 55.2 2532-2-1242），遵循 3R 原则。
- 雌性免疫健全 BALB/c 小鼠，6–8 周龄（Envigo，Cat# 16205F），进房适应一周；IVC 笼具、12 h 光暗循环、22°C、每笼 2–4 只，饲料饮水自由摄取。
- 人道终点：肿瘤负荷 > 0.52 cm³ 或出现痛苦体征即安乐死。
准备一：熟练掌握第 4 乳腺脂肪垫原位注射
正式实验前需通过练习达到稳定、准确的原位注射水平（要点见分步方案第 12 步）。
准备二：熟练掌握腋窝淋巴结分离
第 4 乳腺脂肪垫的引流淋巴结为腋窝淋巴结（axLN），体积小、位置深：
- 用针头把小鼠四肢固定于解剖板；沿腹正中线剪开皮肤（下腹 → 颈部），再向两前肢方向各剪一刀。
- 淋巴结打开皮肤后不可见，需用精细镊小心剔除结缔组织和脂肪，直至露出珍珠白色、椭圆形的小结构。
- 该区域血管丰富，务必整颗完整摘除；碰破血管会出血遮蔽视野，大幅增加辨认难度。
实验设计优化
- 每组至少 3 只小鼠，每只 1 个生物学重复；正式实验前针对自己的比较目的做样本量计算。
- 同一小鼠左右两侧腋窝淋巴结合并计为 1 个生物学重复；额外预留动物应对损耗；各组样本尽量并行处理。
- 必须设对照：无瘤小鼠的正常腋窝淋巴结（naïve LN）并行处理。
- 本方案研究转移前 TDLN：以取材时未检出转移细胞为判定标准（原文用 GFP 标记肿瘤细胞 + 流式确认；也可用免疫荧光或 qPCR 替代）。
- 剔除标准：注射失败（含腹腔成瘤）、未成瘤、ISF 产量不足；终点肿瘤体积需落在目标值 ±20% 以内（约 500 mm³）。
材料与设备（关键配方）
| 类别 | 名称 | 来源 / 编号 |
|---|---|---|
| 化学品 | 胎牛血清（FBS） | Sigma Aldrich，F7524 |
| 青霉素-链霉素（10,000 U/mL） | Thermo Fisher，15140122 | |
| DMEM 高糖含丙酮酸钠 | Thermo Fisher，41966052 | |
| 胰酶-EDTA 溶液 / 台盼蓝 | Sigma T4049 / Thermo T10282 | |
| Corning Matrigel GFR | Corning，354230 | |
| TCEP-HCl（Pierce Premium） | Thermo Fisher，PG82089 | |
| 2-氯乙酰胺（CAA） | Sigma Aldrich，22790-250G-F | |
| Buffer A/B、LC/MS 级水、SDB-RPS 膜片、Trypsin/Lys-C | Fisher LS118-500 / LS122500 / W6500；Sigma 66886-U；Promega V5071 | |
| 动物用药 | 异氟烷 Iso-Vet 1000 mg/g | Dechra |
| 安乃近注射液 500 mg/mL | Hexal | |
| Bepanthen 眼鼻软膏 | Bayer | |
| Octenisept 无醇伤口消毒液 | Schülke | |
| 细胞系 | 4T1（RRID:CVCL_0125）/ 67NR（RRID:CVCL_9723），BALB/c 乳腺肿瘤来源 | Karmanos Cancer Institute（Fred Miller 实验室）；4T1 亦可购自 ATCC CRL-2539 |
| 动物 | BALB/c OlaHsd 雌性野生型，6–8 周龄 | Envigo，16205F |
| 耗材器械 | 29G 胰岛素注射器；皮肤闭合夹 7 mm + 施夹器 | BD 324892；Reflex RF7 CS / RF7 APL |
| 虹膜剪 9 cm 弯；Dumont #55 / #7 精细镊 | Fine Science Tools 14061-09 / 11255-20 / 11271-30 | |
| 20 μm 细胞滤网；LoBind 管 1.5 mL；Whatman 40 号滤纸 | pluriSelect 43-10020-50；Eppendorf 0030108116；Merck WHA1440042 | |
| 设备 | Countess 自动细胞计数仪；NanoDrop One | Thermo Fisher A49862 / ND-ONE-W |
| 离心机 5424 R / 5810 R；ThermoMixer C；真空浓缩仪 | Eppendorf | |
| EASYnLC 1200 + Orbitrap Exploris 480 | Thermo Fisher | |
| KERN 分析天平；异氟烷麻醉系统 | KERN；Groppler | |
| 软件 | Prism 8.1.0；R 4.3.2 + RStudio；ggplot2 3.3.6；EnhancedVolcano 1.22.0；umap 0.2.10；DIA-NN 1.8；Xcalibur | 见原文关键资源表 |
| 数据 | 质谱蛋白组数据；R 脚本模板 | PRIDE PXD066773；Zenodo 10.5281/zenodo.21293916 |
配方表 1：完全 DMEM（细胞培养液）
| 试剂 | 终浓度 |
|---|---|
| DMEM 高糖含丙酮酸钠 | — |
| FBS | 10% |
| 青霉素-链霉素 | 1% |
无菌环境配制，4°C 保存，四周内用完。
配方表 2：5× 还原/烷基化母液
| 试剂 | 目标终浓度（加入样品后） |
|---|---|
| TCEP-HCl | 10 mM |
| 2-氯乙酰胺（CAA） | 30 mM |
| Tris-HCl pH 8.5 | 100 mM |
现用现配，21°C 避光保存，多余母液不可储存或重复使用。母液为 5× 浓度：取样品体积 1/5 的母液加入即得上述终浓度（故母液应按 50 / 150 / 500 mM 配制）。
分步方案
A. 乳腺癌细胞准备（4T1 / 67NR）
- 4T1 或 67NR 用完全 DMEM 于 37°C、5% CO₂ 常规培养。
- 无菌超净台内用预热 PBS 洗一遍。
- 加入预热至 37°C 的 0.25% 胰酶-EDTA，置 37°C 培养箱消化。
- 加足量新鲜培养液终止消化，转入 15 mL 离心管。
- 台盼蓝计数并评估活力：活力 ≥ 80% 才能保证良好成瘤率。
- 取所需细胞量，300 × g 离心 5 min（4°C）沉淀。
- 用冷 PBS 重悬洗去残余培养基，再次 300 × g、5 min、4°C 离心。
- 按模型重悬：4T1 1 × 10⁵ 个/mL（冷 PBS；每脂肪垫 50 μL = 5,000 个细胞）；67NR 2 × 10⁶ 个/mL（冷 PBS : Matrigel = 1:1；每脂肪垫 50 μL = 100,000 个细胞）。计算用量时注意是双侧注射，并留余量。
- 细胞悬液置冰上保存，直到接种。
B. 第 4 乳腺脂肪垫原位注射
- 小鼠准备：6–8 周龄健康雌性 BALB/c；剃除第 4 乳腺脂肪垫对应下腹部区域的毛。
- 镇痛与麻醉：术前 1 h 皮下注射安乃近镇痛（按动物许可执行）；异氟烷诱导仓麻醉（O₂ 2 L/min，3.5%），以爪夹反射消失确认后接入鼻罩维持（O₂ 2 L/min，2.5%）；涂眼膏防角膜干燥。
- 细胞接种：精细剪在第 4 脂肪垫水平做一小口切开腹部皮肤 → 蘸无醇消毒液的灭菌棉签把皮肤与右侧脂肪垫轻轻分离 → 轻柔重悬细胞，29G 胰岛素注射器装载 100 μL → 镊子提起脂肪垫，缓慢进针推注，脂肪垫内形成可见"液泡"即为到位 → 保持推杆压力的同时缓慢退针 → 左侧重复 → 双侧完成后皮肤闭合夹关切口，移离麻醉台，涂无醇消毒液，苏醒全程监护；术后每日观察。
- 肿瘤生长监测：第 5 天起每周 3 次用游标卡尺测量每个肿瘤长、宽；体积按椭球公式
V = π/6 × 长 × 宽²计算，直至达到终点。
C. 取材与组织处理
- 按动物许可批准的方法安乐死（如颈椎脱臼或 CO₂）。
- 针头固定四肢；70% 酒精喷洒体表，降低取材污染风险。
- 沿下腹至颈部剪开皮肤中线，再向两前肢方向各做垂直切口。
- 用精细镊分离原发肿瘤与腋窝淋巴结（本模型中即 TDLN）。
- 12 孔板加预冷无菌 PBS，清洗离体器官去除血液与碎屑；全程冰上操作。
- Whatman 滤纸轻轻吸干组织表面水分。
- 精密天平逐一称重并记录；称重后放回 12 孔板，冰上暂存至下一步。
- 每只小鼠记录：取材时肿瘤体积与重量；淋巴结身份（TDLN 或 naïve LN）与重量；ISF 体积产率。
D. 低速离心分离 ISF（TDLN 与原发瘤通用）
- 准备 1.5 mL 管：剪掉管盖，每管管口放置一片 20 μm 细胞滤网。
- 组织取出，用 Whatman 滤纸轻柔吸干。
- 组织置于滤网上，顶部滴加 10 μL 预冷无菌 PBS：淋巴结保持完整不剪（体积小）；肿瘤剪成约 50 mg 小块，保证 ISF 充分挤出。
- 150 × g、4°C 离心 10 min。
- 轻柔吸取上清（即 ISF），勿搅动管底沉淀（沉淀可能含细胞碎片与小细胞）。
- ISF 转入新 1.5 mL 低吸附管，置干冰速冻，−80°C 长期保存。
- （可选）离心后的剩余组织可继续用于流式细胞术或 OCT 包埋，也可弃置。
产量参考：naïve 腋窝淋巴结每份合并样品约回收 2–4 μL；TDLN 约 8–10 μL（视大小）；约 500 mg 肿瘤约 50 μL。
E. ISF 蛋白酶解与质谱分析
- 按配方表 2 现配 5× 还原/烷基化母液。
- 向 ISF 加入母液，使 TCEP、CAA、Tris-HCl pH 8.5 终浓度分别为 10 mM、30 mM、100 mM。
- 95°C、1000 rpm 恒温混匀仪加热 10 min。
- 每样品加 1.5 μg Trypsin/Lys-C，37°C、1000 rpm 酶解 16 h。
- 用自制 SDB-RPS StageTips 固相萃取柱脱盐。
- 真空浓缩干燥后用 0.1% 甲酸复溶。
- NanoDrop 测肽段浓度，各样品均一化，保证进样量一致。
- 纳升反相液相 + 电喷雾串联质谱（DIA 采集）：每样品进样 300 ng，流速 300 nL/min，柱温 55°C；Buffer B 非线性梯度从 3% 升至 98%，历时 2 h；Full MS 扫描 m/z 300–1650（AGC 3 × 10⁶）；随后 32 个 MS/MS 扫描（NCE 27%，AGC 1 × 10⁶）。
F. 蛋白组原始数据预处理
- 用 DIA-NN（v1.8）处理 DIA 原始文件：开启 FASTA digest（无谱图库检索）；开启深度学习预测谱图、保留时间（RT）与离子迁移率（IM）。
- 检索参数（其余保持默认）：前体 FDR = 1%；前体离子 m/z 300–1650；碎片离子 m/z 200–1650；命令行开启
--relaxed-prot-inf；开启 MBR，定量策略选 "robust LC (high accuracy)"；比对最新版小鼠 UniProt FASTA 数据库。 - 过滤定量蛋白组：至少在一个实验组内有效值占比 ≥ 70% 才保留。
- 剩余缺失值用左删失（left-censored）法填补：从宽度 0.3、相对实测值分布下移 1.8 个标准差的正态分布中随机取值（Perseus 软件平台操作）。
G. 下游生信分析与可视化
可复现 R 脚本模板：Zenodo 10.5281/zenodo.21293916。
- 确定比较组，双尾 t 检验，p 值用 Benjamini–Hochberg 法校正。
- 用 EnhancedVolcano（v1.22.0）绘制火山图：以 |log₂FC| ≥ 1 且校正 p < 0.05 定义显著差异蛋白。
- 对标准化蛋白丰度做 UMAP（umap R 包 v0.2.10，ggplot2 v3.3.6 出图），非线性降维观察样本整体关系。
- 用标准化丰度绘制热图，展示各样本表达模式与组间异同。
预期结果
- 该离心法可从实体组织稳定获得 ISF，产量满足质谱需求，同时把胞内区室污染降到最低，实现可靠的胞外蛋白组刻画。
- 低速离心不损伤组织：离心后淋巴结细胞活力不变、免疫荧光（Collagen I / CD3 / LYVE1）显示组织结构完整——同一份组织还能接着做流式或包埋切片。
- 预期 TDLN 与 naïve LN 的 ISF 蛋白图谱明显不同（转移前重塑）；不同转移能力的模型（4T1 vs 67NR）之间也应存在差异。
- 最终目标是找出"由肿瘤分泌或由肿瘤诱导"、且在原发瘤与 TDLN 间共享的胞外蛋白，为肿瘤驱动重塑与转移前龛形成提供模型特异的标志物。
定量与统计分析
双尾 t 检验 + Benjamini-Hochberg 校正；以倍数变化和校正 p 值做比较分析与可视化（火山图）。
局限性
- 胞外蛋白组常被高丰度血浆来源蛋白（免疫球蛋白、白蛋白）主导，可能掩盖低丰度细胞因子、趋化因子；需配合多重免疫分析或 ELISA 平台（如 LegendPlex）补充检测。
- 取材过程中的蛋白酶解会导致不稳定胞外蛋白部分降解；冰上快速操作可减轻但不能完全避免。
- 凋亡或脆弱细胞仍可能漏出胞内蛋白，无法完全杜绝；下游应严格按"胞外注释蛋白"过滤。
- 该方法只提供某一时间点的快照；本方案针对转移前腋窝 TDLN 优化，已转移淋巴结的 ISF 组成可能不同，需单独评估。
- 从淋巴结获取 ISF 必须添加 PBS，所得为稀释的胞外液，绝对蛋白浓度不能直接反映体内原位浓度。
- 不保留空间信息，无法识别肿瘤或淋巴结内的区域异质性；淋巴结 ISF 产量低，可能需要加大样本量或合并策略。
Troubleshooting
| 问题 | 关联步骤 | 可能原因与解决方案 |
|---|---|---|
| 1. 原位注射技术波动大 | 步骤 12 | 原位注射需要专门训练与练习才能准确、一致；第 4 脂肪垫位置深，务必熟练辨认后再进入正式实验 |
| 2. 肿瘤生长不均一 | 步骤 13 | 注射前用自动细胞计数仪核实活力与浓度；优化注射细胞数——太少可能被排斥，太多则生长过快 |
| 3. ISF 体积不足 | 步骤 28 | 确认离心机 4°C、室温 21°C；高温环境用封口膜覆盖滤网与组织减少蒸发；仍不足则增加合并淋巴结数或生物学重复，不要加大 PBS 体积（会进一步稀释胞外蛋白，影响定量比较） |
| 4. 重复间变异大 | 步骤 48 | 多源于 ISF 产量不一致或取材时间不统一；严格标准化取材时点，严守离心参数与保存流程 |
资源与数据
- 通讯作者（资源索取）：Angela Riedel（angela.riedel@uni-wuerzburg.de）；技术联系人（方案执行问题）：Greta Mattavelli（greta.mattavelli@uni-wuerzburg.de）
- 质谱数据：PRIDE PXD066773（ProteomeXchange）；R 脚本模板：Zenodo 10.5281/zenodo.21293916
- 许可：CC BY 4.0 开放获取