用 Arduino LED 系统实现人类端脑类器官 cAMP 的光遗传学控制
作者：Issei S. Shimada, Yoichi Kato（名古屋市立大学）
期刊：STAR Protocols ｜ DOI：10.1016/j.xpro.2026.104818 ｜ PMC：PMC13571311 ｜ 发表：2026-09-02
说明：中文编译版供学习交流，版权归原作者与出版方所有（CC BY 4.0）。
1. 背景与原理
环磷酸腺苷（cAMP）是细胞内最重要的第二信使之一。GPCR 激活后，Gαs 刺激腺苷酸环化酶产生 cAMP。cAMP 的一个核心功能是负调控 Sonic hedgehog（SHH）信号通路——它促进 GLI3 剪切为其抑制形式，从而压制 SHH 靶基因转录。
SHH 是脑发育的关键形态发生素，决定神经管中神经干细胞（NSC）的背/腹轴；在前脑（含端脑）中促进腹侧身份。初级纤毛（细胞表面的"天线"样细胞器）中，受体 GPR161 产生的 cAMP 激活 PKA → PKA 磷酸化 GLI3 → GLI3 被泛素化加工为 N 端抑制体。因此，cAMP 是抑制 SHH 信号的关键分子。
提高细胞内 cAMP 的常用光遗传工具是光激活腺苷酸环化酶 bPAC。因其暗态基础活性偏高，本文采用低暗态活性突变体 bPACF198Y；需要定位到初级纤毛时，在 N 端融合纤毛标记蛋白 Arl13b。iPS 细胞中推荐把表达框定点插入 19 号染色体的 AAVS1 安全港位点，获得稳定表达细胞株。
整套光遗传系统只有四个组成部分：表达光响应蛋白的细胞 + 470 nm LED + Arduino 控制器 + 控制光照时序的代码。不需要焊接，代码直接复制上传，同样适用于其他类器官研究方向的 cAMP 操控。
2. LED 控制器硬件清单
表 1：主要元件
| 元件 | 厂商 / 货号 |
|---|---|
| Arduino Uno SMD R3 | Arduino, A000073 |
| Gravity: Easy Relay Module（继电器模块） | DFRobot, DFR0643 |
| 公对公杜邦线 | Digikey, 1528-1967-ND |
| 数字传感器线 | DFRobot, FIT0756 |
| Arduino 外壳 | Hammond Manufacturing, 1593HAMARTBU |
| 470 nm LED 装置（激活 bPAC） | Optocode, LEDB-SBOXHP |
| 660 nm LED 台灯（暗室操作照明） | Optocode, LED660-100STND |
| LED 电源适配器（24 V DC, 0.5 A，中心正极） | Li Tone Electronics, LTE10UW-S4-BSA1 |
| Arduino 电源适配器（5 V DC, 1.0 A，中心正极） | Linkman, ATS005T-W050U |
| USB Type-A 转 Type-B 数据线 | Sanwa Supply, KU-R1AC |
主要抗体：ARL13B（Proteintech 17711-1-AP）、GFP (B-2)（Santa Cruz sc-9996）、PAX6（BioLegend 901301）、NKX2.1/TTF-1（Diagnostic BioSystems MOB285-01），均 1:500 稀释；对应种属 Alexa Fluor 二抗（Invitrogen）。主要细胞系：201B7 iPS（Riken）；GPR161 KO 与 bPAC 表达细胞系由通讯作者提供。
3. 试剂配方
表 2：诱导培养基（总体积 10 mL；4°C 保存 ≤1 周）
| 试剂 | 储液浓度 | 终浓度 | 用量 |
|---|---|---|---|
| DMEM/F12 | 1× | — | 7.67 mL |
| KnockOut Serum Replacement | 100% | 20% | 2 mL |
| MEM-NEAA | 100× | 1× | 100 μL |
| L-谷氨酰胺 | 100× | 1× | 100 μL |
| 青/链霉素 | 100× | 1× | 100 μL |
| 2-巯基乙醇 | 1%（144 mM） | 100 μM | 7 μL |
| LDN-193189 | 2 mM | 100 nM | 0.5 μL |
| SB-431542 | 10 mM | 10 μM | 10 μL |
| XAV939 | 2 mM | 2 μM | 10 μL |
表 3：皮层类器官培养基 1（总体积 50 mL；4°C 保存 ≤1 个月）
| 试剂 | 储液浓度 | 终浓度 | 用量 |
|---|---|---|---|
| DMEM/F12 | 100% | 50% | 23.86 mL |
| MACS Neuro medium | 100% | 50% | 23.86 mL |
| N2 MAX | 100× | 0.5× | 250 μL |
| L-谷氨酰胺 | 100× | 1× | 500 μL |
| MEM-NEAA | 100× | 1× | 500 μL |
| 胰岛素 | 9.5–11.5 mg/mL | ~2.5 μg/mL | 12.5 μL |
| 2-巯基乙醇 | 1%（144 mM） | 50 μM | 17.5 μL |
| 青/链霉素 | 100× | 1× | 500 μL |
| NeuroBrew-21（无维生素 A） | 50× | 0.5× | 500 μL |
皮层类器官培养基 2（50 mL；4°C 保存 ≤1 个月）：与培养基 1 相同，但 NeuroBrew-21 换成含维生素 A 版本（500 μL），并额外加入抗坏血酸（1 M 储液，终浓度 200 μM，10 μL）。
表 4：核转染缓冲液与 EDTA 相关溶液
| 溶液 | 配方 | 保存 |
|---|---|---|
| Nucleofection solution（500 μL） | Solution A 10 μL + Solution B 490 μL | 现配现用 |
| Solution A（10 mL） | ATP 2 g（330 mM）+ MgCl₂·6H₂O 1.2 g（590.3 mM），加水定容 | −20°C ≤1 年 |
| Solution B（500 mL） | KH₂PO₄ 6 g（88.2 mM）+ NaHCO₃ 0.6 g（14.3 mM）+ 葡萄糖 0.2 g（2.22 mM），NaOH 调 pH 7.4，加水定容 | −20°C ≤1 年 |
| EDTA 储液（0.5 M，pH 8，50 mL） | 二水 EDTA 二钠 9.31 g，NaOH 调 pH 8.0，定容 | 4°C ≤12 个月 |
| EDTA 工作液（0.5 mM，50 mL） | 0.5 M EDTA 50 μL + PBS 49.95 mL | 4°C ≤6 个月 |
| TrypLE/EDTA 溶液（50 mL） | TrypLE 25 mL + 0.5 mM EDTA 溶液 25 mL | 4°C ≤6 个月 |
4. 分步方案
第 1 部分：安装 Arduino IDE（30 min）
安装最新版 Arduino IDE（本方案在 2.3.10 测试通过）；支持 Windows 10+（64 位）、macOS 10.15+（64 位）与 Linux（64 位）。
第 2 部分：采购元件（2 周，含物流）
按表 1 备齐全部元件。660 nm LED 台灯装进组织培养柜，供暗房操作时照明。
第 3 部分：组装 LED 控制器（1 h）
- 三根公对公杜邦线接到数字传感器线上。
- 杜邦线穿过 Arduino 外壳开口：一侧一根、另一侧两根。
- 信号线接 Arduino Uno 数字引脚 10；其余两根接 5 V 与 GND。
- 拧紧螺丝，合上外壳。
- 传感器线接 Gravity: Easy Relay Module，继电器开关拨到常闭（NC）档。
- 24 V 适配器接继电器 VIN，LED 电源线接 VOUT。
- 5 V 适配器给 Arduino 供电；只在上传程序时才连 USB 数据线。
- 对照确认 LED、继电器模块、Arduino 连接无误。只有 LED 照明单元进培养箱，Arduino 与电源留在箱外。
第 4 部分：编写并上传程序（1 h）
- 新建 sketch（File > New Sketch），写入下方代码（示例：100 ms 开 / 2 min 关循环）。
- 数据 USB 线连电脑，板卡选择 "Arduino Uno"（端口一般自动选中，否则 Tools > Port 手动选）。
- 点 Verify 编译，点 Upload 上传（几秒完成）。
- 改光周期只需改
ON_MILLISECOND/OFF_MILLISECOND（单位 ms）。
const uint8_t OUTPUT_PIN = 10;
const unsigned long ON_MILLISECOND = 100UL;
const unsigned long OFF_MILLISECOND = 120000UL;
void setup() { pinMode(OUTPUT_PIN, OUTPUT); }
void loop() {
digitalWrite(OUTPUT_PIN, HIGH);
delay(ON_MILLISECOND);
digitalWrite(OUTPUT_PIN, LOW);
delay(OFF_MILLISECOND);
}
第 5 部分：CRISPR-Cas9 构建 GPR161 敲除 iPS 细胞（3–4 周）
开始前：iPS 细胞培养在 35 mm 皿（StemFit + iMatrix，直接向培养基加 iMatrix 0.2 μg/cm²，无需预包被）至 60–70% 汇合（约 4–7 天）；常规每 5–7 天传代，传代后前 24 h 加 10 μM Y-27632。35 mm 皿用 1 mL StemFit + 4 μL iMatrix。
步骤 7｜组装 CRISPR/Cas9 RNP 复合物（约 1 h）
- 混合 2 μL ATTO 550-tracrRNA（100 μM）与 2 μL GPR161 crRNA（100 μM；序列 GATCTTCATGGGGTACACCA）。
- 95°C 变性 5 min，自然冷却至室温。
- 加 1 μL HiFi Cas9 nuclease v3（10 mg/mL），室温避光孵育 30 min 成 RNP。混匀靠吹打，不要涡旋。期间准备电转细胞。
步骤 8｜制备 iPS 细胞用于电转（约 1 h）
- 吸去培养基，加 0.5 mL EDTA 溶液（细胞培养超 7 天时先 37°C 孵育 1 min 再轻柔吸去）；立即吸去 EDTA，加 0.4 mL TrypLE/EDTA，37°C 孵育 5 min。
- 细胞悬液转入 1.5 mL 管，0.5 mL DMEM/F12 洗皿两次并入同一管（残留细胞靠吹打收集，过度吹打会损伤细胞）。
- 190 × g 离心 3 min（水平转子），弃上清；0.5 mL DMEM/F12 重悬计数。
- 取 3 × 10⁵ 个细胞转入新管，离心弃上清（一个 35 mm 皿一般够 2–4 次核转染）。
- 用 100 μL 含 GPR161 RNP 复合物的核转染缓冲液重悬，转入电转杯，Nucleofector 2b 程序 B-016 电转。
- 立即用 5 mL DMEM/F12 回收，190 × g 离心 3 min；用 1 mL StemFit + Y-27632（10 μM）重悬，接种到含 iMatrix 的 35 mm 皿。
步骤 9｜FACS 分选单克隆、建立 GPR161 KO 株（3–4 周）
- 次日先用 EDTA 再用 TrypLE/EDTA 收集细胞，重悬于 StemFit + Y-27632（10 μM）+ DAPI（1:500）。ATTO 550 信号会衰减，收细胞前尽量少暴露于荧光显微镜。
- FACSAria III 分选：FSC-A/SSC-A 排碎片 → FSC-A/FSC-W 选单细胞、排 DAPI 阳性死细胞 → 以未转染 + DAPI 细胞为阴性对照定义 ATTO 550 阳性门。约 1%–10% 细胞为阳性。
- 单克隆化（二选一）：① 每孔 1 个细胞分选到 96 孔板培养 7 天，存活率约 10%–20%，需要多克隆时备 5–10 块板；分选前每孔加 100 μL StemFit + Y-27632 + iMatrix（按 9 孔计：1 mL StemFit + 1 μL Y-27632 + 1.2 μL iMatrix，多配 100 μL 补损耗）。② 100 个细胞分选进管，接种 35 mm 皿，4–6 天后手动挑克隆（挑前 0.5 mM EDTA 处理 1 min）。
- 每个克隆取约一半细胞提基因组 DNA，其余扩增；Sanger 测序鉴定 KO 克隆。20 个克隆都测不到编辑说明 gRNA 效率低，建议换序列重设计。
- 扩增目标克隆并冻存。暂停点：KO 株可在此冷冻保存。
第 6 部分：生成用于光遗传学的细胞（3–4 周）
用 CRISPR/Cas9 把 bPACF198Y-EGFP 表达框插入 AAVS1 位点。同时构建胞质定位（cyto-bPACF198Y-EGFP）与纤毛定位（Arl13b-bPACF198Y-EGFP）两种版本，分别分析胞质 cAMP 与初级纤毛 cAMP 的作用。
- 每孔 6,000 个 GPR161 KO iPS 细胞接种 24 孔板。
- 次日 Lipofectamine Stem 转染：1 μL Lipofectamine Stem 稀释于 25 μL Opti-MEM；另将 250 ng pAAVS1-CAG-bPACF198Y-EGFP（或 Arl13b 版）+ 250 ng pXAT2 稀释于 25 μL Opti-MEM；合并、涡旋 2–3 s、室温静置 10 min，逐滴加入。
- 次日荧光显微镜观察 GFP 阳性细胞。阳性数会先减少（未整合质粒的瞬时表达消退）；转染 2 周后仍保留 GFP 的才是稳定整合细胞。
- 培养至汇合（4–7 天）；按步骤 9 门控分选 GFP 阳性细胞，每孔 1 个细胞分选到 96 孔板。
- 确认 GFP 稳定表达后冻存。暂停点：可在此冷冻保存。
第 7 部分：程序化光照下生成端脑类器官（2 周）
准备：需要两台 CO₂ 培养箱（一台光照板、一台暗对照板）。光照强度参考值约 6.0 mW/cm²（距发光面约 5 mm、LED 开启约 1 min 后测，厂家数据）。
- iPS 细胞培养在 12 孔板 1–2 个孔中，至 60–70% 汇合（一般够铺一块 96 孔板）。
- 消化并计数。
- 按 3,000 个细胞/孔准备：12 孔用 1.3 mL 诱导培养基备 39,000 个细胞（+1 孔冗余）；整板至少 300,000 个 / 10 mL。始终多备一点补偿损耗。
- 190 × g 离心 3 min，弃上清。
- 用含 50 μM Y-27632 的诱导培养基按 3,000 细胞/100 μL 重悬，每孔 100 μL 铺入 U 型底超低吸附 96 孔板。LED 线缆从培养箱走线孔穿出（没有走线孔就从门缝穿过，不夹扁、不锐角弯折），必要时用封口膜封住残余缝隙。⚠ 关键：走线后确认培养箱温度与 CO₂ 浓度稳定。
- 建立光照与暗对照：光照板放到 LED 上开开关；暗对照板放入另一台培养箱。⚠ 关键：从本步起所有操作在 660 nm LED 灯下进行；保持房间黑暗，开房间灯时不要打开这两台培养箱。
- 第 6 天前每 2–3 天换一半培养基（Y-27632 只在前两天用）。换液技巧：用 200 μL 枪头从液面顶部轻轻吸 50 μL（健康类器官沉底，从顶部吸避免误吸）；超净台垫深蓝色垫板更易观察白色/半透明的类器官；第 1 天底部看不到细胞团可能是忘了加 Y-27632。
- 第 6 天：吸走全部培养基，换 100 μL 皮层类器官培养基 1。吸不净就用"逐步稀释法"：吸 90% → 加 100 μL 新液 → 再吸 90% → 再加 100 μL。
- 第 6–14 天每 2–3 天换一半。超过 14 天：类器官转 6 孔板、换 1.5 mL 皮层类器官培养基 2，轨道摇床（如 Taitec CS-LR）70 rpm 培养，每 1–4 天换一半。LED 单元可放在摇床上、板叠在 LED 上——线缆留足余量，防止缠绕、钩挂或甩脱。
第 8 部分：固定、切片与染色（1 周）
- 类器官转入新 1.5 mL 管（枪头剪掉尖部扩大开口），700 μL 4% 多聚甲醛/PBS，4°C 固定 3–4 h。
- 弃固定液，700 μL 30% 蔗糖/PBS，4°C 渗透 12–16 h。
- 转入一次性包底模具（类器官放靠边处便于切片时定位），加 OCT 包埋，−80°C 冻存。暂停点：OCT 块可 −80°C 保存至切片。
- 冰冻切片机切 16 μm 切片，贴防脱载玻片。暂停点：切片 −20°C 可保存 1 年。
- 封闭与染色（封闭液 = PBS + 3% 正常山羊血清 + 0.3% Triton X-100）：PBS 洗去 OCT → 室温封闭 1 h → 一抗 4°C 12–16 h → PBS 洗 → 二抗 + DAPI（1:500）室温 1 h → Fluoromount-G 封片。
- 显微镜成像。
5. 预期结果
LED 按程序设定开/关，本方案用 100 ms 开 / 2 min 关循环，周期可按实验设计修改。
用胞质/纤毛两种 bPACF198Y-EGFP 的 GPR161 KO iPS 细胞构建端脑类器官：免疫组化显示 GFP 分别定位于胞质或 ARL13B 阳性初级纤毛。不照光的 GPR161 KO 类器官——背侧标志物 PAX6 表达降低、腹侧标志物 NKX2.1 在脑室区异位升高（GPR161 缺失 → cAMP 下降 → SHH 去抑制）。光照两周激活 cyto- 或 cilia-bPAC 后：NKX2.1 染色减弱、PAX6 染色增强（两种定位均如此），与原文定量结果一致——光遗传学升高 cAMP 成功调控了类器官的背/腹模式化。
6. Troubleshooting
| 问题 | 对应步骤 | 解决方案 |
|---|---|---|
| Arduino IDE 报错、程序跑不通 | "编写程序"部分 | 检查代码拼写错误；确认上传成功；检查各元件连线；核对 IDE 版本 |
| LED 不亮 | 组装步骤 4–6 | 逐一检查 LED 单元、继电器模块、24 V 适配器、Arduino 与杜邦线连接；高温高湿可能损坏 LED 单元 |
| 类器官不成团 | 生成类器官步骤 1–4 | 确认诱导培养基新鲜；确认加了 Y-27632；部分 iPS 细胞系难以高效成类器官，改用 201B7 或已验证细胞系 |
| 光照组两周后状态变差 | 生成类器官步骤 6–9 | LED 照射可能升温或造成胁迫——确认光照期间培养箱温度稳定，必要时减少照射时长/频率；可用细胞胁迫/活力检测试剂评估 |
7. 局限性
- 时钟精度：光照时序依赖 Arduino 内部时钟，与高精度参考时钟相比有漂移——两周培养期内光照周期相对绝对时间会轻微偏移，固定间隔内的循环数略有差异。但现有装置已足以影响类器官的生物学行为，可作为光遗传学在生命科学中普及的第一步。
- 可扩展性：大批量实验需要多个 LED 照明单元；长期培养扩到多块板时还需多个轨道摇床。
8. 资源可用性
通讯/技术联系人：Issei S. Shimada（ishimada@med.nagoya-cu.ac.jp）；独特试剂可索取（需完成材料转移协议）；Arduino 代码见正文与 Zenodo（zenodo.org/records/21673121）。