干细胞变身“肾上腺细胞”：50 天分化方案全流程拆解

这个 Protocol 做什么？

把 H9 人胚胎干细胞（hESC）一步步“养成”肾上腺嗜铬样细胞（hESC-CCs）。养出来的细胞会表达儿茶酚胺能标志物（TH、DβH、PNMT、CgA），并且有真本事：能兴奋、有电压门控钙通道，高钾刺激下钙会涌进来，patch-clamp 记录还能看到动作电位和钠电流。

为什么值得做？嗜铬细胞是研究儿茶酚胺分泌与肾上腺素能功能的经典模型，但原代取材来源有限（牛、大鼠肾上腺髓质），批次差异大。这套方案用一个明确组分的 3D 悬浮培养体系拿到功能成熟的嗜铬样细胞，全程约 50 天，不用饲养层，培养基组成全部列明。

流程四阶段：

1. hESC 扩增 + 类胚体（EB）形成
2. 尾侧神经祖细胞（CNP）诱导（第 0–5 天，视黄酸尾化）
3. 神经嵴细胞（NCC）诱导（第 5–11 天，BMP2 + FGF2）
4. 嗜铬谱系分化与功能成熟（第 11–50 天，BMP4 + 糖皮质激素 + PMA）

开始之前

• 本方案以 H9 系（WiCell WA09）为例，其他 hESC 系同样适用，但需自行验证。
• 所有培养基提前配制、无菌操作；hESC 培养全程不加抗生素，无菌要求更高。
• 重组蛋白按厂家建议分装，−20°C 可存 12 个月；地塞米松要放 −80°C。
• 小分子和因子（CHIR99021、SB431542、BMP2、FGF2、RA）现用现补进培养基，避免反复冻融；RA 避光。
• 伦理：使用 hESC 需所在机构伦理委员会批准（原文为 UNAM 医学院 117/2019 号批件）。

材料清单（核心）

细胞与耗材

项目	来源 / 货号
H9 人胚胎干细胞（WA09）	WiCell
AggreWell™800 微孔板	STEMCELL, Cat# 34815
6 孔超低吸附板	Corning, Cat# 3401
18 mm 硼硅酸盐圆形盖玻片	Fisherbrand

关键试剂

试剂	用途
StemFlex™ 培养基 + Y-27632（10 μM）	hESC 维持与解离后存活
Matrigel® Growth Factor Reduced	铺板基质
TrypLE™ Express	解离（别超过 5 分钟）
CHIR99021（3 μM）+ SB431542（10 μM）	尾侧神经诱导
视黄酸 RA（1 μM，第 3 天加入）	尾化
BMP2（10 ng/mL）+ FGF2（20 ng/mL）	神经嵴诱导
BMP4（500 pg/mL）+ 地塞米松（50 μM）+ PMA（100 nM）	嗜铬分化与成熟
Fluo-4 AM（2 μM）	钙成像
Poly-L-lysine	盖玻片包被

常用液体配方（摘自原文 Key resources table）

溶液	关键组成
PBS	NaCl 137 mM / KCl 2.7 mM / NaH₂PO₄ 10 mM / Na₂HPO₄ 1.8 mM
Tyrode's 液（500 mL）	NaCl 137 mM / KCl 5 mM / CaCl₂ / MgCl₂ 1 mM / HEPES 10 mM / 葡萄糖 10 mM
高钾液（60 mM KCl）	KCl 60 mM / NaCl 78 mM / HEPES 10 mM / CaCl₂ 2 mM
电泳内液（50 mL）	KCl 135 mM / NaCl 5 mM / EGTA 1 mM / HEPES 10 mM / MgCl₂ 2 mM / CaCl₂ 0.5 mM / ATP-Mg 2 mM / GTP-Mg 1 mM
尾侧神经诱导液（10 mL）	Neurobasal : DMEM/F12 = 1:1，加 ITS、N2、B27(−VitA)、葡萄糖 0.3%、青链霉素、CHIR99021 3 μM、SB431542 10 μM
神经嵴诱导液（10 mL）	同上基础液，改加 BMP2 10 ng/mL、FGF2 20 ng/mL
嗜铬分化液（100 mL）	DMEM/F12 + GlutaMAX + B27(2×) + BSA 0.5% + 青链霉素 + BMP4 500 pg/mL + 地塞米松 50 μM + PMA 100 nM
封闭液（10 mL）	PBS + BSA 3% + Triton X-100 0.1%

抗体（均为常用商品化抗体，稀释比按原文）：SOX10、PHOX2B（Santa Cruz）；TH（Sigma, AB152）；DDC（Sigma, AB1569）；PNMT、CgA、Cav1.2（Invitrogen）；二抗为 Alexa Fluor 488/594（Jackson）。

分步实验方案

步骤 1｜hESC 维持与 EB 形成（分化前）

1a. 复苏与扩增

1. 37°C 水浴冻存管，至只剩小冰晶。
2. 转入含 37°C 预温 KnockOut™ DMEM 的 15 mL 离心管，300 × g 离心。
3. 弃上清，用含 10 μM Y-27632 的 StemFlex™ 轻柔重悬。
4. 接种到 Matrigel® 包被板，37°C / 5% CO₂ 培养。
5. 24 h 后换成不含 Y-27632 的新鲜 StemFlex™，之后每 48 h 换液。
6. 长到 80% 融合度再进入下一步。

1b. 解离与 EB 形成

1. PBS（无钙镁）洗一次，加 TrypLE™ Express 37°C 消化 3–5 min。
2. 转入含预温 KnockOut™ DMEM 的离心管，300 × g 离心。
3. 用含 10 μM Y-27632 的 StemFlex™ 重悬，台盼蓝计数活率。
4. 按每微孔 8,000–10,000 个活细胞接入 AggreWell™800（每孔 300 微孔）。
5. 100 × g 离心让细胞沉入微孔，37°C / 5% CO₂ 培养。
6. 24 h 后换不含 Y-27632 的新鲜培养基。

步骤 2｜向尾侧神经祖细胞（CNP）分化（第 0–5 天）

1. EB 形成后 24–48 h，用宽口枪头从 AggreWell™ 微孔里取出 EB，15 mL 管自然沉降 2–3 min，去上清，重悬于尾侧神经诱导液。
2. 把约 300 个 EB（来自一个 AggreWell™ 孔）分到超低吸附 6 孔板的 2 个孔里。
3. 每天全量换尾侧神经诱导液。
4. 第 3 天，换含 1 μM RA 的诱导液。
5. 第 5 天停用 RA，继续尾侧神经诱导液。

步骤 3｜向神经嵴细胞（NCC）分化（第 5–11 天）

1. 换成神经嵴诱导液（BMP2 + FGF2），之后每 48 h 全量换液，持续 6 天。
2. 第 11 天，用剪掉尖头的 1000 μL 枪头把球转移进 60×15 mm 培养皿。
3. 加 1 mL 0.5 mM EDTA（PBS 配）37°C 孵育 10–15 min。
4. P1000 轻柔吹打至单细胞悬液。
5. 转入含 3 mL 预温嗜铬分化液的离心管，300 × g 离心 3 min（室温）。
6. 种到多聚赖氨酸包被的盖玻片上，用含 10 μM Y-27632 的嗜铬分化液培养——这份细胞留做免疫荧光验证神经嵴标志（SOX10 等）。

步骤 4｜NCC 向嗜铬样细胞分化（第 11–20 天）

1. 吸掉神经嵴诱导液，球用 0.5 mM EDTA 37°C 处理 10–15 min。
2. 轻柔吹打成单细胞，转入含 5 mL 预温嗜铬分化液的离心管，300 × g 离心 3 min。
3. 用含 10 μM Y-27632 的嗜铬分化液重悬，接回 AggreWell™800。
4. 24–48 h 后把新形成的球转到超低吸附孔（每孔约 150 个）。
5. 24 h 后换不含 Y-27632 的嗜铬分化液。
6. 维持 9 天，每 2 天全量换液。

步骤 5｜延长培养获得功能成熟（第 20–50 天）

• 第 21 天起，同一批球继续泡在嗜铬分化液里，每 2 天换液直到第 50 天。
• 这 30 天是功能成熟的关键窗口：细胞在这个阶段逐步获得与原代嗜铬细胞相似的电生理与分泌特性，形态上也能看到典型的球形细胞（原文 Figure 4 箭头所指）。

步骤 6｜下游应用前的准备

1. EDTA 解离球（10–15 min，37°C），轻柔吹打成单细胞。
2. 离心后用含 10 μM Y-27632 的嗜铬分化液重悬。
3. 种到多聚赖氨酸包被盖玻片上。
4. 24 h 后换不含 Y-27632 的培养基。
5. 72 h 内用完——再久细胞会从盖玻片上脱落。

步骤 7｜免疫荧光表型鉴定

1. 1× PBS 洗一次，4% PFA 室温固定 15 min。
2. PBS 洗 3 次 × 5 min；抗原修复液 45°C 孵育 25 min，室温冷却 15 min，再洗 3 次。
3. 封闭液（BSA 3% + Triton 0.1%）通透+封闭 40 min。
4. 一抗（2% PBS/BSA 稀释）4°C 湿盒过夜（约 18 h）。
5. 次日室温平衡 30 min，PBS 洗 3 次。
6. 荧光二抗（PBS 稀释）室温避光 2 h。
7. DAPI 1:10000 复染 5 min，终洗 10 min，DAKO 封片剂封片，荧光或共聚焦成像。

步骤 8｜功能鉴定 A：钙成像

1. 当天配 500 mL 新鲜 Tyrode's 液。
2. 盖玻片上的细胞用 2 μM Fluo-4 AM 37°C 避光负载 30 min。
3. PBS 洗去染料，装入倒置荧光显微镜记录槽。
4. Tyrode's 液重力灌流 2 mL/min；480/40 nm 激发，527/30 nm 发射（Leica L5 滤光块）。
5. 40× 油镜 + 冷却 CCD，曝光 60 ms、间隔 380 ms，存 multi-TIFF。
6. 基线记录后，给 1 s 高钾（60 mM KCl）脉冲，再记录 60 s——电压门控钙通道开放的细胞会看到明显钙峰。

步骤 9｜功能鉴定 B：膜片钳

1. 拉制 1.2 mm 硼硅玻璃电极，入液电阻 2–5 MΩ。
2. 全细胞模式，HEKA EPC-10 放大器，电流钳记录。
3. 按球形形态挑取目标细胞，微操纵器接近。
4. 电压钳下给 +5 mV 测试脉冲，轻吸形成 >1 GΩ 封接，补偿快电容。
5. 短促强吸引破膜，补偿慢电容；串联电阻 >20 MΩ 或补偿超过 80% 的细胞弃掉。
6. 转电流钳，跑电流刺激方案，记录动作电位。

常见问题排查（Troubleshooting）

#	问题	对策
1	克隆没到 80% 融合就从板上掉了	核对 Matrigel 批次最适稀释度；换一瓶新的 hESC 保证遗传完整性与细胞健康
2	接入 AggreWell 后 48 h 内大量死亡 / 不成 EB	TrypLE 不要超过 5 min；操作轻柔、EB 转移用宽口枪头；接种后头 24 h 务必加 10 μM Y-27632；必要时做 NANOG/OCT4 染色确认多能性
3	EB 大小不均	每微孔提到 10,000 个细胞；加样时让细胞均匀分布，最后沿孔中央缓慢补液
4	尾化差 / 神经嵴转换效率低	用验证过的分装 aliquot，避免反复冻融；RA 全程避光；按时全量换液；各孔球密度保持一致
5	TH 阳性细胞得率低 / 分化不全	起始培养必须健康未分化；严格按分化与成熟时间表走，补料按时按量——小偏差就会影响最终得率
6	免疫荧光背景高 / 信号弱	PFA 用新鲜的；按流程封闭通透；优化一抗二抗稀释比；设无一抗对照；二抗和 DAPI 孵育全程避光
7	钙信号弱或没有	现配 2 μM Fluo-4 AM 工作液；确认负载充分、灌流和刺激给药正常；核对 Tyrode's 与高钾液的组成和 pH

预期结果

• 约 50 天拿到 hESC-CCs，免疫荧光可见 TH、DβH、PNMT、CgA 阳性，形态与牛/大鼠原代嗜铬细胞相似。
• 钙成像：高钾刺激下出现瞬态胞内钙升高，证明电压门控钙通道有功能。
• 膜片钳：去极化达阈值可触发动作电位，并记录到电压门控钠电流。
• 不同分化批次间可重复性较好（原文自述）。

局限性

• 对起始 hESC 质量敏感：克隆形态、活率、多能性状态都会影响结果；不同细胞系效率有差异。
• 培养周期长（约 50 天），不适合赶时间的项目。
• 时间节点、接种密度、换液节奏、因子操作稍有波动就可能影响分化效率和成熟度。