给蚊子"接种"病毒：胸腔注射 vs 人工血餐，双路径感染埃及伊蚊

这篇方案解决什么问题

媒介效能（vector competence）实验是虫媒病毒研究的核心，但各实验室的操作细节差异很大：蚊龄、麻醉方式、血餐温度、取唾液的时间点都不统一，结果难以横向比较。这套来自巴西 Fiocruz 的标准化流程，把两种感染路径 + 一套下游评估整合成一个可复现的框架：

• 胸腔显微注射：病毒直接注入血体腔，绕过中肠屏障，研究系统性感染之后的扩散与传播；
• 人工血餐：模拟自然经口感染，研究中肠感染动态；
• 下游统一做唾液采集 + 中肠/躯体解剖，量化感染率（IR）、扩散率（DR）、传播率（TR）和各组织病毒载量。

文中以登革病毒（DENV）、寨卡病毒（ZIKV）、基孔肯雅病毒（CHIKV）、马亚罗病毒（MAYV）和 Oropouche 病毒（OROV）为验证对象，框架可推广到其他虫媒病毒。创新点在于：两条感染路径互为补充，按病毒外潜伏期（EIP）设计采样时间，再加上麻醉与操作细节的优化（提高存活率与感染效率），把分散在各家实验室的经验整合成单一流程。

实验前准备

蚊虫饲养与预处理（约 2–3 周）

• 胸腔注射用 3–5 日龄雌蚊——蚊龄越小，注射后死亡率越低。NOTE日龄偏大的雌蚊表皮角质层增厚，针尖更难刺入。
• 人工血餐用 约 7 日龄雌蚊——这个蚊龄吸血效率最好。
• 实验前全程用 10% 蔗糖水饲养；拟吸血组实验前饥饿 24 h 刺激取食。
• CRITICAL注射和血餐实验都必须使用已交配雌蚊——交配维持正常生殖生理和生殖营养周期，是人工血餐成功的前提。
• NOTE本文使用埃及伊蚊 RecL 实验室品系（2004 年采自巴西累西腓），饲养条件 26 ± 1°C、湿度 50%–60%、12 h 光照/12 h 黑暗。

病毒贮液制备（约 2–10 天，视病毒而定）

• 用对应病毒的许可细胞系制备滴度明确的病毒贮液。NOTEDENV 在 C6/36 细胞增殖、TCID₅₀ 滴定；ZIKV、CHIKV、MAYV、OROV 在 Vero 细胞增殖、空斑试验（PFU/mL）滴定。
• 胸腔注射：经校准的 Nanoject II 微量注射器，每只蚊约注入 700 PFU / 69 nL。CRITICAL病毒分装临用前解冻，全程置于冰上。
• 人工血餐：先用 MOI = 0.1 做生长动力学实验确定最佳收获时间，保证目标滴度且血中仍有活细胞。CRITICAL滴度稳定一致是结果可复现的基础。
• NOTE采样时间点（dpe）按外潜伏期（EIP）设计：黄病毒（DENV、ZIKV）约 7–14 天；甲病毒（CHIKV、MAYV）约 2–7 天；正布尼亚病毒（OROV）约 5–10 天。

材料清单（关键资源表）

病毒与细胞

化学试剂

实验动物与器材

分步方案

步骤 1：胸腔显微注射（1–2 h）

1. 显微注射系统搭建：用 CO₂ 麻醉蚊子（配合冷冻表面）。CRITICAL麻醉不当会显著推高死亡率——温暖环境冰块融化快，水汽会让蚊子粘在湿表面、气门堵塞甚至苏醒逃逸，应短暂 CO₂ 麻醉与冰面麻醉交替，控制单次时长。
2. 校准注射系统：按目标剂量与注射器参数调整注射体积；选合适玻璃毛细管针——校准不当或体积过大会明显增加死亡率。NOTE毛细管针一般用拉针仪自行拉制。OPTIONAL按 1 μL 色素 / 20 μL 液体加食用蓝色素，目视确认注射成功。阴性对照用 1× PBS、超纯水或未感染细胞上清。
3. 注射操作：蚊子成排摆在冷冻面上；病毒悬液装入毛细管针；体视镜下于侧胸部、中胸与后胸交界处（翅下浅色线、与第二对足齐平）进针，保持体位一致、减少损伤。CRITICAL注射部位错误会导致死亡率上升和感染结果变异。
4. 注射后恢复：转入恢复笼，饲以蔗糖水直至采样；转移动作轻缓。

图 1：(A) 蚊子成排排列以便连续注射，同时处理的数量按操作者速度调整，避免麻醉复苏。(B) 进针位置（红圈）：中胸–后胸交界侧胸面。原文附 Methods 视频 S1。

步骤 2：人工血餐感染（1–2 h）

1. 膜餐系统搭建：塑料培养皿封三层 Parafilm 作饲血膜，底部留小口灌注血餐；备热源（如暖宝宝）维持约 37°C。
2. 血餐配制与饲喂：病毒培养液与去纤维兔血 1:1 混合，补 ATP 至终浓度 3 mM；阴性对照用未感染细胞培养物同法配制。留取病毒液和血餐 aliquot 做滴度质控。血餐灌入膜餐系统，饲血器置于蚊笼顶部；热源每 15 min 更换维持 37°C。吸血不超过 1 h。CRITICAL血餐病毒滴度随时间衰减，后吸血个体摄入剂量偏低，务必限时。麻醉后挑出完全饱血雌蚊；第 0 天收代表性蚊子确认病毒摄入与摄入滴度。

NOTE初次感染血餐后，按实验设计间隔再给一次非感染性血餐，可能通过促进病毒从中肠逃逸而增强扩散与传播。

步骤 3：唾液采集（2–3 h）

1. 强泌唾系统搭建：玻璃培养皿内铺橡皮泥条固定 10 μL 塑料吸头；每头灌约 10 μL FBS + 30% 蔗糖收集液。NOTE拟做细胞培养检测可用滤芯吸头；无滤芯吸头毛细作用更好、唾液吸取更充分。
2. 泌唾操作：CO₂ 麻醉转冷皿；细镊去翅足固定；蚊子侧放，喙小心插入收集吸头（Methods 视频 S2——喙在液面下可见活动说明蚊子存活）；26 ± 1°C 保持约 30 min。NOTE时长可调（±10 min），过久会因 RNA 降解降低样品质量。结束后将收集液吹入标记管，冰上操作，−80°C 保存。

步骤 4：解剖——中肠与躯体（2–3 h）

1. 解剖准备：细镊使用前与样本间均需灭菌；体视镜下玻璃皿盛 1× PBS；备好 70% 乙醇、蒸馏水、1× PBS 三个容器逐只浸洗。
2. 解剖操作：唾液采集后立即逐只处理。CRITICAL解剖必须紧随唾液采集，快处理与冷存材料提前备齐。NOTE唾液采集与解剖用同一批蚊子、流程需衔接，建议至少两人配合。依次浸洗 70% 乙醇 → 蒸馏水 → 1× PBS；一镊固定胸部、另一镊轻拉腹部分离；从前腹端拉出中肠，去除马氏管等附着结构入标记管；剩余躯体（头、胸及残余组织）作 carcass 入另一管。CRITICAL避免拉破中肠——肠内容物泄漏会污染躯体样品造成假阳性。全部样品 −80°C 保存（Methods 视频 S3）。

步骤 5：媒介效能评估

1. 病毒检测：唾液按目的选直接 RT-qPCR、接种敏感细胞观察 CPE、或接种蚊子后 RNA 提取 + RT-qPCR；中肠/躯体按实验室标准流程 RNA 提取 + RT-qPCR。NOTERT-qPCR 尽量用绝对定量——既判读阳阴性，还能比较各组病毒载量。
2. 媒介效能参数：
   感染率 IR = 中肠阳性蚊 / 全部受检饱血蚊 × 100%；
   扩散率 DR = 躯体阳性蚊 / 中肠阳性蚊 × 100%；
   传播率 TR = 唾液阳性蚊 / 扩散感染蚊 × 100%。

预期结果

• 胸腔注射：病毒绕过中肠屏障直接入血体腔，个体间感染接近一致，适合评估系统性感染及后续扩散、传播。
• 人工血餐：感染率受吸血效率和时间影响；血餐滴度随饲喂进程衰减，后吸血个体接触剂量偏低。条件优化到位时，相当比例的饱血雌蚊应被感染。
• 唾液采集：仅部分蚊子唾液可检出病毒 RNA 或感染性颗粒——传播率通常低于感染率和扩散率，因为唾液阳性依赖病毒成功扩散到唾液腺并释放。除非用荧光示踪等标记，单只蚊子是否成功泌唾无法直接确认。
• 解读时考虑病毒–媒介配对的生态学相关性：本方案给出的是实验室受控条件下的媒介效能，不一定完全等同于自然界的传播动态。

局限性

• 胸腔注射高效建立感染，但绕过中肠等天然屏障，不适合研究自然感染动态；校准或操作不当还会增加死亡率、引入剂量变异。
• 人工血餐高度依赖吸血行为——蚊龄、营养状态、环境条件都会造成波动；血餐滴度随时间（尤其温度控制不佳时）下降。
• 唾液采集与解剖费时费力且依赖操作者，中肠意外破裂有交叉污染风险；各实验室强泌唾装置差异也会影响可复现性。

Troubleshooting

要点速记

1. 两条感染路径各有分工：注射看系统性感染，血餐看自然感染动态，不要混着解读。
2. 时间点跟着 EIP 走：黄病毒 7–14 天、甲病毒 2–7 天、正布尼亚病毒 5–10 天。
3. 三个率层层递进：IR（中肠）→ DR（躯体，以中肠阳性为分母）→ TR（唾液，以扩散感染为分母），报告时务必写清分母。
4. 全程生物安全先行：按病毒等级取得机构生物安全批准，所有感染蚊操作都在防逃逸的封闭设施内进行。