1. 领域背景与文献引入
文献英文标题：Spatial resolved transcriptomics reveals distinct cross-talk between cancer cells and tumor-associated macrophages in intrahepatic cholangiocarcinoma；发表期刊：Biomarker Research；影响因子：未公开；研究领域：肝内胆管癌肿瘤微环境与细胞相互作用。
肝内胆管癌（intrahepatic cholangiocarcinoma, iCCA）是全球发病率持续上升的高度致命肝胆恶性肿瘤，患者5年生存率不足10%，其恶性进展与复杂的肿瘤微环境（tumor microenvironment, TME）密切相关。领域共识：iCCA的TME由肿瘤相关巨噬细胞（tumor-associated macrophages, TAMs）、癌相关成纤维细胞等多种细胞组成，其中TAMs作为最丰富的免疫细胞亚群，通过促进肿瘤增殖、血管生成及免疫抑制参与iCCA进展。然而，现有研究多基于bulk RNA-seq或单细胞RNA-seq（single-cell RNA sequencing, scRNA-seq）解析细胞异质性，缺乏空间分辨的iCCA TME细胞互作分析——TAMs在iCCA TME中的重编程机制、与癌细胞亚克隆的空间邻近性及功能互作尚未完全阐明。
本研究的核心初衷是通过空间转录组学（spatial transcriptomics, ST）与数字空间Profiler（digital spatial profiler, DSP）技术，在保留组织空间架构的前提下解析iCCA的细胞组成、空间异质性及癌细胞与TAMs的相互作用，填补iCCA TME空间机制的研究空白，为iCCA的免疫抑制微环境解析及靶向治疗策略开发提供新见解。
2. 文献综述解析
文献综述的核心评述逻辑围绕“iCCA TME复杂性→现有技术局限性→空间转录组学的解决价值”展开：作者首先总结iCCA的临床困境（高死亡率、TME异质性），强调TAMs作为TME关键细胞对肿瘤进展的驱动作用；随后指出，尽管scRNA-seq能解析细胞亚群异质性，但无法提供细胞的空间位置信息，难以揭示TME中细胞间的“邻近-功能”关联；最后提出，空间转录组学技术（如ST）可保留组织的空间架构，为解析iCCA TME的细胞互作提供“位置-基因-功能”的三维信息。
现有研究的关键结论包括：①TAMs通过表型重编程（如M2极化）促进iCCA发生发展；②iCCA癌细胞存在亚克隆异质性，但亚克隆与TAMs的空间互作未明。现有技术的优势是scRNA-seq的高分辨率细胞分群，局限性是缺失空间信息；而本研究的创新价值在于首次将ST与DSP技术结合，在空间分辨水平解析iCCA的TME架构，揭示TFF3（三叶因子3）介导的癌细胞与TAMs互作机制，为iCCA的免疫抑制微环境研究提供新视角。
3. 研究思路总结与详细解析
本研究的整体框架：以“解析iCCA空间转录组异质性及癌细胞-TAMs互作”为目标，围绕“空间细胞分群→互作预测→功能验证”的逻辑展开，技术路线为“临床样本收集→ST/DSP文库构建→空间细胞分群→受体-配体互作分析→体外细胞实验验证”。
3.1 临床样本收集与空间转录组文库构建
实验目的是获取iCCA临床样本并构建空间转录组文库，为后续分析提供基础。方法细节：收集3例iCCA患者手术标本（山东大学齐鲁医院），OCT包埋后制备10μm冷冻切片；HE染色后由病理学家标注肿瘤区、间质区及正常肝细胞区；采用10x Genomics Visium平台构建空间转录组文库，Illumina NovaSeq6000测序，每样本捕获约3000个spots（每个spot覆盖约10个细胞）。结果解读：成功构建3例iCCA样本的空间转录组文库，病理标注的肿瘤区高表达上皮细胞marker KRT19，间质区高表达成纤维细胞marker ACTA2，验证了文库的组织特异性。实验所用关键产品：SAKURA的OCT包埋剂（货号4583）、MP Biomedicals的Lysing Matrix D（货号116913050）、10x Genomics的Visium Spatial Gene Expression平台。
3.2 空间细胞分群与异质性分析
实验目的是解析iCCA的空间细胞组成及癌细胞亚克隆异质性。方法细节：用STUtility与Seurat软件分析ST数据，结合病理标注与marker基因（KRT19为癌细胞、CD68为巨噬细胞、ALB为肝细胞）将spots分为5类：癌细胞区（56.27%）、巨噬细胞富集区（14.72%）、肝细胞区（10.61%）、免疫细胞区（9.41%）及成纤维细胞/ECM区（8.99%）；用SPOTlight工具整合GSE138709的scRNA-seq数据，解析每个spot的细胞类型比例；采用DSP技术在相邻切片上验证——通过PanCK（癌细胞）、CD68（巨噬细胞）、CD3（T细胞）抗体标记区域-of-interest（ROI），分析区域转录组相似性。结果解读：iCCA的TME中巨噬细胞是最丰富的免疫细胞，癌细胞区占比最高且呈空间异质性分布（如患者1的癌细胞分为TFF3高表达亚克隆、SLC2A1高表达亚克隆等）；DSP验证显示，空间邻近的ROI转录组相似性高，与ST的空间分群结果一致，证实iCCA癌细胞亚克隆的空间分布受“物理邻近性”驱动。实验所用关键产品：Novus的PanCK抗体（货号NBP2-33200）、SantaCruz的CD3抗体（货号sc-20047AF594）、Proteintech的CD68抗体（货号16646-1-AP）。
3.3 癌细胞与TAMs的互作解析
实验目的是揭示癌细胞与TAMs的空间互作机制。方法细节：用CellChat_v2工具分析ST数据中的受体-配体相互作用，预测细胞间信号传递；用Monocle软件构建癌细胞伪时间轨迹，分析TFF3的动态表达；通过免疫组化（immunohistochemistry, IHC）验证临床样本中TFF3的表达，用多重免疫荧光（multiplexed immunofluorescence, mIF）检测TFF3与CD163（M2巨噬细胞marker）、S100A4/S100A8（促肿瘤巨噬细胞marker）的共定位。结果解读：TFF3高表达的癌细胞亚克隆与巨噬细胞的互作强度最高（受体-配体对数量最多）；伪时间分析显示TFF3在癌细胞进化过程中持续高表达，提示其参与肿瘤恶性进展；IHC显示TFF3在肿瘤区域显著高表达（AOD值高于正常胆管，n=3，P<0.05），mIF进一步证实TFF3阳性癌细胞周围聚集CD163、S100A4、S100A8阳性巨噬细胞，直接提示TFF3介导癌细胞与TAMs的空间互作。实验所用关键产品：Proteintech的TFF3抗体（货号23277-1-AP）、CD163抗体（货号16646-1-AP）、S100A4抗体（货号16105-1-AP）、S100A8抗体（货号15792-1-AP）。
3.4 体外功能验证
实验目的是验证TFF3对巨噬细胞重编程的功能作用。方法细节：用100ng/ml佛波酯（phorbol-12-myristate-13-acetate, PMA）诱导人单核细胞系THP-1分化为M0巨噬细胞，与iCCA细胞系（QBC-939、HUCCT1）的条件培养基共培养48h；设计siRNA敲低QBC-939细胞的TFF3，通过qPCR检测巨噬细胞M2 marker（CD163、CD206、ARG-1、IL-10）及S100A4、S100A8的mRNA表达，免疫印迹验证蛋白水平。结果解读：iCCA细胞条件培养基显著诱导M0巨噬细胞向M2表型转化——M2 marker及S100A蛋白表达均显著上调（n=3，P<0.05）；敲低TFF3后，上述基因/蛋白表达水平较对照组下降约50%（n=3，P<0.05），直接证实TFF3是癌细胞诱导巨噬细胞促肿瘤重编程的关键因子。实验所用关键产品：Thermo-Fisher Scientific的PMA（领域常规使用）、Qiagen的RNeasy Mini Kit、Applied Biosystems的Power SYBR Green Master Mix。
4. Biomarker 研究及发现成果解析
Biomarker定位与筛选逻辑
本研究聚焦的Biomarker为TFF3（三叶因子3），属于分泌型蛋白 Biomarker。其筛选与验证逻辑为“空间转录组筛选→临床样本验证→体外功能验证”：首先通过ST分析发现iCCA癌细胞亚克隆高表达TFF3；随后通过IHC验证临床样本中TFF3的肿瘤特异性表达；最后通过体外细胞实验证实其介导癌细胞与TAMs互作的功能。
研究过程详述
TFF3来源于iCCA癌细胞，主要通过癌细胞分泌进入TME。验证方法包括：①临床样本IHC：对3例研究样本及24例独立队列样本进行TFF3 IHC染色，结果显示TFF3在肿瘤区域显著高表达（AOD值高于正常胆管，n=3，P<0.05），24例独立队列中16例TFF3阳性且与CD163（M2巨噬细胞）共定位；②细胞系验证：通过qPCR与免疫印迹检测iCCA细胞系（QBC-939、HUCCT1）中TFF3的表达，证实其在癌细胞中高表达；③功能验证：通过siRNA敲低实验，证实TFF3是癌细胞诱导巨噬细胞促肿瘤重编程的关键因子。
特异性方面，TFF3在iCCA肿瘤区域的表达显著高于正常胆管组织（n=3，P<0.05）；敏感性方面，文献未明确报道ROC曲线 AUC值，但24例独立队列中16例TFF3阳性（阳性率约66.7%），提示其具有一定的临床相关性。
核心成果提炼
TFF3的核心功能关联为“iCCA癌细胞分泌的促肿瘤因子，介导TAMs向M2表型重编程”：①TFF3高表达的癌细胞亚克隆与巨噬细胞互作最强，提示其在TME细胞通讯中的核心作用；②体外实验证实，TFF3敲低可显著抑制巨噬细胞M2 marker（CD163、IL-10）及S100A4/S100A8的表达，直接关联iCCA的免疫抑制微环境；③临床样本中TFF3与CD163的共定位，提示其与iCCA患者的不良预后相关（推测，文献未明确生存分析，但M2巨噬细胞富集通常提示预后不良）。
其创新性在于首次在空间分辨水平揭示TFF3介导的癌细胞与TAMs互作，突破了传统非空间技术无法解析“位置-功能”关联的局限，为iCCA的治疗靶点提供了新候选——靶向TFF3可能抑制TAMs的促肿瘤重编程，改善iCCA患者的免疫抑制状态。
本研究通过空间转录组学技术解析了iCCA的空间架构与细胞互作，为iCCA的TME研究提供了重要的空间视角，TFF3作为关键互作因子，有望成为iCCA的潜在治疗靶点。