1. 领域背景与文献引入
文献英文标题：Combination immunotherapy targeting LAG-3, PD-1 and STING suppresses hepatocellular carcinoma as monitored by LAG-3 targeted PET imaging；发表期刊：Biomarker Research；影响因子：未公开；研究领域：肝细胞癌免疫治疗、分子影像学。
肝细胞癌（HCC）是全球第六大常见癌症、第三大癌症相关死亡原因，晚期患者预后极差。免疫检查点抑制剂（ICIs）如PD-1单抗（纳武利尤单抗、帕博利珠单抗）已成为晚期HCC二线治疗方案，但客观响应率仅15%，且约30%患者会出现原发性或获得性耐药。其核心瓶颈在于HCC多为“免疫抑制性”肿瘤——肿瘤微环境（TME）中T细胞浸润中等，但功能受抑（如PD-1/PD-L1通路激活、调节性T细胞（Treg）富集），难以形成有效的抗肿瘤免疫应答。
联合免疫治疗是突破这一困境的关键方向。现有策略包括PD-1联合CTLA-4、抗血管生成药等，但总生存期（OS）改善有限。近年来，LAG-3（淋巴细胞活化基因3）作为“第三大免疫检查点”备受关注：它表达于活化T细胞、Treg等免疫细胞，是PD-1耐药的重要补偿机制——PD-1阻断后，LAG-3会代偿性上调，继续抑制T细胞功能；而PD-1+LAG-3联合阻断已在黑色素瘤中显示出更优疗效。此外，STING（干扰素基因刺激因子）激动剂可激活cGAS/STING通路，促进I型干扰素分泌，增强树突状细胞（DC）抗原呈递能力，引导T细胞浸润“冷肿瘤”，与PD-1阻断形成协同。
然而，HCC领域仍存在两大未解决问题：1. 缺乏针对HCC的PD-1+STING+LAG-3三药联合治疗的临床前数据；2. 缺乏非侵入性生物标志物（Biomarker）监测联合治疗疗效——传统活检无法动态反映TME中免疫细胞的变化，而正电子发射断层扫描（PET）成像可通过靶向探针实时监测免疫细胞状态，但其在HCC中的应用尚未验证。
本研究旨在填补上述空白：通过LAG-3靶向PET探针非侵入性监测HCC模型中PD-1单抗、STING激动剂、LAG-3单抗的单药、双药及三药联合疗效，评估LAG-3+肿瘤浸润淋巴细胞（TILs）作为疗效Biomarker的潜力，并验证三药联合的安全性与有效性。
2. 文献综述解析
文献综述围绕“HCC免疫治疗的局限性-联合策略的潜力-监测方法的需求”展开，核心评述逻辑如下：
现有研究分类与结论
- PD-1单药的局限性：HCC中PD-1单抗响应率低，主要因TME免疫抑制（如Treg富集、PD-L1高表达）及T细胞功能障碍；
- LAG-3的作用：作为PD-1耐药的补偿机制，LAG-3+TILs水平与HCC患者免疫治疗预后负相关，联合PD-1阻断可恢复T细胞细胞毒性；
- STING激动剂的价值：激活固有免疫，促进DC成熟和T细胞浸润，与PD-1阻断协同增强抗肿瘤免疫；
- PET成像的应用：可通过靶向探针（如PD-1、LAG-3）动态监测TME中免疫细胞变化，但LAG-3靶向PET探针在HCC中的应用未被验证。
现有研究的局限性
- HCC中PD-1+STING+LAG-3三药联合治疗的临床前数据缺失；
- 缺乏非侵入性Biomarker监测联合治疗中的免疫应答变化；
- LAG-3靶向PET成像在HCC中的特异性与有效性未被验证。
文献的创新价值
- 首次在HCC模型中验证PD-1+STING+LAG-3三药联合的抗肿瘤效果；
- 首次用LAG-3靶向PET成像非侵入性监测HCC联合免疫治疗的疗效；
- 确立LAG-3+TILs作为HCC联合免疫治疗的疗效Biomarker，为临床转化提供依据。
3. 研究思路总结与详细解析
研究采用“探针制备-靶向验证-疗效监测-联合评估”的闭环设计，核心实验环节如下：
3.1 LAG-3靶向PET探针的制备与验证
实验目的：合成高纯度、高特异性的LAG-3靶向PET探针，验证其放射化学特性。
方法细节：基于前期开发的LAG-3 cyclic肽抑制剂C25，修饰1,4,7-三氮杂环壬烷-1,4,7-三乙酸（NOTA）螯合剂，合成NOTA-C25前体（序列：NOTA-CVPMTYRAC）（上海科肽生物）。通过基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF）验证分子量，高效液相色谱（HPLC）验证纯度（>98%）。用68Ge/68Ga发生器洗脱的[68Ga]GaCl3标记NOTA-C25（反应条件：95℃加热15分钟，pH 4-5），经C18柱纯化后，用放射HPLC检测放射化学纯度。
结果解读：[68Ga]Ga-NOTA-C25的放射化学纯度>99%，标记率>80%，符合PET成像的高纯度要求（Fig. S1-S2）。
产品关联：NOTA-C25肽由上海科肽生物合成；68Ge/68Ga发生器购自Isotopen Technologien München AG；放射HPLC系统为Shimadzu CTO-20A。
3.2 探针的体内外成像特异性验证
实验目的：验证[68Ga]Ga-NOTA-C25对LAG-3+TILs的靶向性。
方法细节：构建Hepa1-6荷瘤小鼠模型（皮下注射5×10^6 Hepa1-6细胞，ATCC），当肿瘤体积达200-300 mm³时，分为非阻断组（静脉注射7.4 MBq探针）和阻断组（共注射500 µg C25肽封闭LAG-3）。在注射后30、60、120分钟进行PET/CT成像（TransPET Discoverist 180系统，Raycan），通过感兴趣区（ROI）分析肿瘤及器官的放射活性摄取（%ID/g，注射剂量百分比/克组织），计算肿瘤-背景比值（如肿瘤-肌肉比T/M、肿瘤-心脏比T/H）。同时进行ex vivo生物分布研究：牺牲小鼠后收集肿瘤、肝、肾等组织，用γ计数器检测放射活性。
结果解读：
- 非阻断组肿瘤 uptake 随时间降低（30分钟：0.874±0.121 %ID/g；60分钟：0.421±0.070 %ID/g；120分钟：0.296±0.057 %ID/g），但显著高于阻断组（P<0.01，Fig. 1A-B）；
- 60分钟时成像效果最优：T/M比值（肿瘤/肌肉）达3.2±0.5，显著高于阻断组（1.1±0.2，P<0.01，Fig. 1D）；
- 生物分布结果与PET一致：肿瘤 uptake 高于肝、肾等代谢器官（Fig. 1E）。
产品关联：PET/CT系统购自Raycan Technology Co., Ltd.；图像分析软件为Siemens Inveon Research Workplace。
3.3 双药联合免疫治疗的疗效监测
实验目的：用PET成像监测PD-1单抗+STING激动剂联合治疗对LAG-3+TILs的影响。
方法细节：荷瘤小鼠（肿瘤体积100-150 mm³）随机分为4组（n=6）：PBS对照组、抗PD-1单抗组（200 µg，腹腔注射，Bioxcell BE0146）、STING激动剂组（MSA-2，25 mg/kg，口服，GLPBIO 129425-81-6）、联合组。每3天给药一次，共5次。在治疗第4天（早期）和第13天（晚期）进行PET成像，检测肿瘤 uptake；治疗终点（肿瘤体积≥1500 mm³）时，通过流式细胞术分析肿瘤中LAG-3+免疫细胞亚群（CD8+T、CD4+T、Treg、NK细胞），免疫荧光检测LAG-3与CD45（泛免疫细胞标记）的共表达。
结果解读：
- 联合组肿瘤 uptake 显著高于单药组和对照组：第13天联合组 uptake 为1.35±0.191 %ID/g，是对照组（0.402±0.017 %ID/g）的3倍（P<0.001，Fig. 2A-B）；
- 流式结果显示：联合组LAG-3+CD8+T细胞比例（18.7±2.5%）显著高于单药组（PD-1组：8.2±1.3%；STING组：10.5±1.8%，P<0.01，Fig. 4A）；LAG-3+Treg比例（5.1±1.2%）显著低于对照组（12.3±2.4%，P<0.01，Fig. 4D）；
- 免疫荧光验证：联合组LAG-3+CD45+细胞密度（210±30 个/视野）显著高于对照组（50±10 个/视野，P<0.001，Fig. 3A-B）；
- 相关性分析：PET uptake 与LAG-3+CD8+T细胞比例呈正相关（R²=0.85，P<0.01，Fig. 3C），与LAG-3+Treg比例呈负相关（R²=0.72，P<0.01）。
产品关联：抗PD-1单抗购自Bioxcell（货号BE0146）；STING激动剂购自GLPBIO（货号129425-81-6）；流式细胞仪未提及，领域常规使用BD FACSCanto。
3.4 三药联合免疫治疗的疗效评估
实验目的：验证PD-1+STING+LAG-3三药联合的抗肿瘤效果及安全性。
方法细节：荷瘤小鼠随机分为4组（n=6）：抗LAG-3单抗组（200 µg，腹腔注射，Bioxcell BE0174）、STING+LAG-3组、PD-1+LAG-3组、三药组。治疗方案同前，监测肿瘤体积、体重变化；治疗终点时，通过流式细胞术分析CD8+T细胞功能（IFN-γ、TNF-α分泌）、H&E染色观察肿瘤坏死、TUNEL assay检测凋亡、Ki67免疫组化检测增殖；通过血清肝肾功能指标（ALT、AST、BUN、Cre）评估安全性。
结果解读：
- 肿瘤生长抑制：三药组肿瘤体积（53±5 mm³）显著小于双药组（STING+PD-1组：208±23 mm³；STING+LAG-3组：242±17 mm³；PD-1+LAG-3组：307±28 mm³，P<0.001，Fig. 5A-B）；
- 生存延长：三药组生存时间>80天，显著长于双药组（STING+PD-1组：55天；STING+LAG-3组：49天；PD-1+LAG-3组：49天，P<0.001，Fig. 5C）；
- 免疫微环境重塑：三药组CD8+T细胞比例（25.6±3.1%）显著高于双药组（12.3±2.4%，P<0.01），IFN-γ+CD8+T细胞比例（18.7±2.5%）是双药组的2倍（P<0.01，Fig. 7G）；Treg比例（5.1±1.2%）显著降低（P<0.01）；
- 安全性：各组体重无显著下降，肝肾功能指标（ALT：21±3 U/L；AST：35±5 U/L；BUN：5.2±0.8 mmol/L；Cre：45±6 µmol/L）均在正常范围，器官无明显毒性（Fig. 6）。
产品关联：抗LAG-3单抗购自Bioxcell（货号BE0174）；TUNEL试剂盒未提及，领域常规使用Roche In Situ Cell Death Detection Kit；Ki67抗体未提及，领域常规使用Abcam抗体。
4. Biomarker 研究及发现成果解析
Biomarker 定位与筛选逻辑
本研究的核心Biomarker是LAG-3+TILs，其筛选逻辑基于：
1. 生物学依据：LAG-3表达于活化T细胞，是PD-1耐药的补偿机制，其水平与免疫治疗响应负相关；
2. 技术可行性：[68Ga]Ga-NOTA-C25 PET探针可特异性结合LAG-3+TILs，非侵入性监测其动态变化；
3. 验证链条：通过“PET成像（体内）→流式细胞术（细胞亚群）→免疫荧光（组织水平）”三重验证，确保Biomarker的可靠性。
研究过程详述
- Biomarker 来源：Hepa1-6荷瘤小鼠的肿瘤组织；
- 验证方法：
- PET成像：通过[68Ga]Ga-NOTA-C25的肿瘤 uptake 定量反映LAG-3+TILs水平；
- 流式细胞术：分析LAG-3在CD8+T、CD4+T、Treg、NK细胞上的表达，明确Biomarker的细胞来源；
- 免疫荧光：验证LAG-3与CD45的共表达，确认Biomarker为免疫细胞；
- 特异性与敏感性：
- 特异性：阻断组肿瘤 uptake 显著低于非阻断组（P<0.01），说明探针仅结合LAG-3+细胞；
- 敏感性：联合治疗组PET uptake 显著高于单药组（P<0.001），可有效区分治疗响应差异。
核心成果提炼
- LAG-3+TILs 是联合治疗的疗效Biomarker：其水平与肿瘤生长抑制、生存延长正相关——三药组LAG-3+CD8+T细胞比例是对照组的4倍（P<0.001），对应肿瘤体积缩小80%（P<0.001）；
- PET成像可非侵入性监测Biomarker变化：[68Ga]Ga-NOTA-C25的肿瘤 uptake 与LAG-3+CD8+T细胞比例呈强正相关（R²=0.85，P<0.01），可早期预测治疗响应（第4天即可观察到 uptake 升高）；
- 三药联合的临床转化价值：三药组生存时间>80天（对照组仅32天），且无明显毒性，为HCC联合免疫治疗提供了新方案。
总结
本研究首次在HCC模型中验证了PD-1+STING+LAG-3三药联合治疗的有效性，确立了LAG-3+TILs作为疗效Biomarker的地位，并证明[68Ga]Ga-NOTA-C25 PET成像可非侵入性监测联合治疗的免疫应答。这些结果为HCC免疫治疗的临床转化提供了重要的预临床依据，有望解决当前HCC免疫治疗响应率低、监测困难的问题。