1. 领域背景与文献引入
文献英文标题：Extracellular miR-6723-5p could serve as a biomarker of limbal epithelial stem/progenitor cell population；发表期刊：Biomarker Research；影响因子：未公开；研究领域：眼科学（角膜缘干细胞生物学）。
角膜缘干细胞（LSCs）位于角膜缘基底上皮，是维持眼表完整性的关键自我更新细胞。当LSCs功能障碍或丢失时，会导致角膜缘干细胞缺乏症（LSCD），表现为角膜混浊、疼痛甚至失明。目前治疗重症LSCD的主要方法是培养角膜缘上皮移植（CLET），但临床成功依赖于移植片中LSCs的含量——回顾性研究显示，移植片中Δp63αbright细胞（公认的LSC surrogate marker）比例≥3%时成功率较高。然而，Δp63α存在局限性：一是抗体缺乏特异性（识别TAp63α和Δp63α两种异构体），二是检测需破坏性免疫染色，无法用于移植前的无创评估。因此，寻找非破坏性、特异性LSC生物标志物是CLET领域的核心未解决问题。
Extracellular miRNAs因稳定性高、易检测（可从体液或培养基中获取），已在癌症、神经疾病中作为生物标志物，但LSC特异的extracellular miRNAs研究尚空白。本研究旨在筛选与cLECs（培养的角膜缘上皮细胞）中LSC比例相关的extracellular miRNAs，为CLET提供无创预后标志物。
2. 文献综述解析
作者对现有研究的评述逻辑按“LSC标志物局限性→extracellular miRNAs作为生物标志物的优势→LSC领域的研究空白”展开：
现有研究总结
- LSC标志物的局限性：目前唯一与CLET临床成功相关的标志物是Δp63αbright细胞比例，但Δp63α抗体不特异（识别两种异构体），且检测需破坏细胞，无法用于移植前评估；其他标志物如K14（上皮干/祖细胞 marker）虽特异，但同样需要细胞水平检测。
- extracellular miRNAs的优势：extracellular miRNAs通过结合Argonaute蛋白或包裹于细胞外囊泡维持稳定，可从体液（如血清、培养基）中无创获取，且具有高特异性和敏感性，已用于癌症分期、治疗反应监测等领域。
- LSC领域的空白：虽有研究报道角膜缘与中央角膜的intracellular miRNAs差异，但LSC特异的extracellular miRNAs尚未被鉴定，无法满足CLET的无创标志物需求。
研究创新价值
本研究首次将extracellular miRNAs与cLECs中的LSC比例关联，通过测序+验证+定位的流程，鉴定出miR-6723-5p作为LSC的extracellular biomarker，解决了现有标志物的破坏性和非特异性问题，为CLET的无创预后评估提供了新候选。
3. 研究思路总结与详细解析
本研究的核心目标是鉴定与cLECs中LSC比例相关的extracellular miRNAs，科学问题是“哪些extracellular miRNAs可反映cLECs中的LSC含量？”，技术路线为“cLECs培养与表型鉴定→条件培养基miRNA测序→RNA提取方法优化→RT-qPCR验证→miRNA组织定位”。
3.1 cLECs培养与表型鉴定
实验目的：获得不同LSC比例（以Δp63αbright细胞比例衡量）的cLECs，并鉴定其表型（排除 stromal 污染、确认上皮纯度）。
方法细节：
- 样本来源：18例健康人角膜缘组织（死亡至保存时间<12h，死亡至实验时间<7天），去除虹膜、内皮等结构后，切取2×2mm角膜缘 explants，接种于脱细胞羊膜（AM）上。
- 培养条件：使用改良SHEM培养基（mSHEM），含ThermoFisher Scientific的DMEM/F-12、Access Biological的5%人血清、ThermoFisher的1% CTS N2 supplement、R&D Systems的0.4ng/mL EGF等，每48h换液。
- 表型鉴定：通过免疫荧光染色检测Δp63α（LSC marker）、K14（上皮干/祖细胞 marker）、K12（分化上皮 marker）、PanCK（上皮 marker）、Vimentin（stromal marker），并通过软件量化细胞比例。
结果解读：
- 共获得72个cLECs样本，上皮纯度高（PanCK+细胞比例98.53%±2.19%），stromal污染低（PanCK-/Vim+细胞比例0.35%±0.64%）；
- Δp63αbright细胞比例范围1.66%~33.1%（平均9.43%±5.91%），无细胞数量与Δp63αbright比例的相关性；
- K14+细胞比例95.58%±3.96%（干/祖细胞占比高），K12+细胞比例1.22%±1.51%（分化细胞少）。
产品关联：实验所用关键产品包括ThermoFisher Scientific的DMEM/F-12培养基、Access Biological的人血清、R&D Systems的EGF、Roche的dispase II、Keyence的BZ-X710显微镜。
3.2 条件培养基处理与miRNA测序
实验目的：筛选与Δp63αbright细胞比例相关的extracellular miRNAs。
方法细节：
- 条件培养基处理：收集每48h的条件培养基，离心去除细胞和碎片后浓缩（3kDa超滤管，浓缩22倍），冻存于-80℃；
- 样本选择：根据Δp63αbright细胞比例，从72个样本中选18个进行测序；
- 测序方法：使用HTG EdgeSeq miRNA全转录组检测（覆盖2083个miRNA），样本与裂解缓冲液1:1混合，加蛋白酶K（50℃孵育180min），采用96孔板检测，以人脑RNA为内参。
结果解读：
- 量化归一化后，线性回归模型显示3个miRNA与Δp63αbright比例显著相关：miR-6723-5p（正相关，p=0.018）、miR-4649-5p（负相关，p=0.024）、miR-6075（负相关，p=0.047）；
- 排除低检测置信度的miR-4649-5p和miR-6075（部分样本未达30 reads阈值），聚焦miR-6723-5p。
产品关联：实验所用关键产品包括Millipore的3kDa Ultra-15离心过滤管、HTG Molecular Diagnostics的miRNA全转录组检测试剂盒。
3.3 RNA提取方法优化与RT-qPCR验证
实验目的：优化条件培养基中RNA提取方法，验证miR-6723-5p与Δp63αbright比例的相关性。
方法细节：
- RNA提取方法比较：测试3种试剂盒（ThermoFisher的miRVana PARIS、Qiagen的miRNeasy micro、Qiagen的miRNeasy Serum/Plasma Advanced），并比较浓缩（arm1）与未浓缩（arm2）的效果，以spike-in cel-miR-39-3p（ThermoFisher）评估提取效率；
- RT-qPCR验证：对17个cLECs条件培养基样本，用miRNeasy Serum/Plasma Advanced kit提取RNA，以cel-miR-39-3p为内参，检测miR-6723-5p、miR-3648等的表达。
结果解读：
- miRNeasy Serum/Plasma Advanced kit的提取效率最高（spike-in回收率70.19%），且浓缩样本的重复性更好；
- RT-qPCR验证显示，miR-6723-5p表达与Δp63αbright比例显著正相关（Pearson相关系数0.75，p=0.0005），57%的方差由Δp63αbright比例解释；
- 其他miRNA（如miR-3648、miR-4449）在高低Δp63αbright组无显著差异。
产品关联：实验所用关键产品包括Qiagen的miRNeasy Serum/Plasma Advanced试剂盒、ThermoFisher的TaqMan microRNA RT kit、cel-miR-39-3p mimic。
3.4 miRNAscope原位杂交定位miR-6723-5p
实验目的：确定miR-6723-5p在人角膜组织中的表达位置（验证与LSCs的空间关联）。
方法细节：
- 样本：3例<50岁、死亡至处理时间<3天的人角膜组织（新鲜冷冻切片，厚度12μm）；
- 实验方法：使用ACD Biosystems的miRNAscope HD Assay Red试剂盒，杂交miR-6723-5p定制探针，以RNU6B（阳性对照）和miR-6723-5p scramble序列（阴性对照）验证特异性。
结果解读：
- miR-6723-5p主要表达于角膜缘基底上皮（LSCs所在位置），而中央角膜和角膜缘表层上皮无表达；
- 阳性对照RNU6B在全层上皮表达，阴性对照无信号，确认结果特异性。
产品关联：实验所用关键产品包括ACD Biosystems的miRNAscope HD Assay Red试剂盒、miR-6723-5p定制探针。
4. Biomarker研究及发现成果解析
Biomarker定位与筛选逻辑
本研究的Biomarker为extracellular miR-6723-5p，筛选与验证逻辑为：
1. 初步筛选：通过HTG EdgeSeq miRNA测序，鉴定出与cLECs中Δp63αbright细胞比例正相关的miR-6723-5p；
2. 方法优化：比较3种RNA提取试剂盒，选择效率最高的miRNeasy Serum/Plasma Advanced kit；
3. 验证：通过RT-qPCR在17个样本中验证miR-6723-5p与Δp63αbright比例的正相关；
4. 定位：通过miRNAscope确认miR-6723-5p在LSCs所在的角膜缘基底上皮表达。
研究过程详述
- Biomarker来源：cLECs条件培养基中的extracellular miRNA；
- 验证方法：RT-qPCR（以cel-miR-39-3p为内参）、miRNAscope原位杂交；
- 相关性数据：miR-6723-5p表达与Δp63αbright比例的Pearson相关系数0.75（p=0.0005，n=17），说明两者高度正相关。
核心成果提炼
- 功能关联：miR-6723-5p的表达水平可反映cLECs中的LSC比例（Δp63αbright细胞比例），是CLET移植片LSC含量的无创指标；
- 创新性：首次鉴定出miR-6723-5p作为cLECs中LSC的extracellular biomarker，解决了现有标志物的破坏性和非特异性问题；
- 临床意义：可用于CLET移植前的无创评估，预测移植成功率，为个性化治疗提供依据。
