慢性淋巴细胞白血病中与预后相关的竞争性内源性RNA网络：综合分析及新型风险评分模型的构建-文献解析

1. 领域背景与文献引入

文献英文标题：Competing endogenous RNA networks related to prognosis in chronic lymphocytic leukemia: comprehensive analyses and construction of a novel risk score model；发表期刊：Biomarker Research；影响因子：4.579；研究领域：慢性淋巴细胞白血病（CLL）的竞争性内源性RNA（ceRNA）网络与预后生物标志物研究。

慢性淋巴细胞白血病（CLL）是西方成人最常见的B细胞恶性肿瘤，以成熟B淋巴细胞克隆性增殖为特征，异质性极强——患者临床进程从“惰性”到“侵袭性”差异显著，染色体异常（如del13q14、del17p）、基因突变（如p53、IGHV）是关键预后因素，但现有生物标志物（如IGHV突变状态）仍无法精准预测所有患者的预后，且缺乏针对性靶向治疗靶点。

竞争性内源性RNA（ceRNA）是近年肿瘤分子机制研究的热点：长链非编码RNA（lncRNA）、环状RNA（circRNA）等非编码RNA可通过“海绵吸附”微RNA（miRNA），解除miRNA对靶 mRNA的抑制，从而调控基因表达。已有研究证实ceRNA网络在胃癌、肝癌等肿瘤中驱动细胞增殖、凋亡及耐药，但CLL中预后相关的ceRNA网络尚未系统解析——虽有散在研究报道circ-CBFB（通过miR-607/FZD3促进CLL进展）、circ-RPL15（作为血浆生物标志物预测CLL进展）等单一非编码RNA的功能，但缺乏多组学整合（RNA测序+临床数据）的ceRNA网络分析，更未结合预后构建风险模型。

本文针对这一空白，通过分析CLL患者、细胞系与健康对照的RNA测序数据，构建预后相关ceRNA网络，建立新型风险评分模型，并验证关键调控轴的功能，为CLL的预后评估与治疗靶点开发提供依据。

2. 文献综述解析

作者首先总结CLL的临床与分子特征：CLL异质性源于染色体异常（如del13q14是最常见异常，del17p提示不良预后）、基因突变（如p53突变导致化疗耐药），现有风险分层依赖IGHV突变状态、del17p等指标，但仍需更精准的生物标志物。

接着评述非编码RNA在CLL中的研究现状：已有研究发现lncRNA CRNDE通过miR-28/NDRG2抑制CLL细胞增殖，circ-RPL15高表达与CLL进展相关，但这些研究聚焦单一非编码RNA，未系统解析ceRNA网络的协同调控作用；且ceRNA网络与CLL预后的关联尚未充分挖掘——缺乏结合RNA测序、生存分析的整合研究。

作者的创新点在于：（1）系统性： 整合CLL患者、细胞系、健康对照的RNA测序数据，鉴定差异表达的lncRNA、circRNA、miRNA、mRNA；（2）预后导向： 通过多步Cox回归构建包含3个基因的风险评分模型，验证其预测价值；（3）功能验证： 构建预后相关ceRNA网络，并通过细胞实验验证关键轴（circ_0002078/miR-185-3p/TCF7L1）的调控机制，填补了CLL中ceRNA网络与预后研究的空白。

3. 研究思路总结与详细解析

3.1 样本收集与RNA测序

实验目的： 获取CLL患者、细胞系与健康对照的RNA表达谱，鉴定差异表达RNA。
方法细节： 纳入865例初发CLL患者，收集4例患者外周血B细胞、2个CLL细胞系（MEC1、EHEB）、6例健康对照的B细胞，进行Illumina RNA测序；以|log₂倍数变化|>2、P<0.05为阈值筛选差异表达RNA（DElncRNA、DEcircRNA、DEmiRNA、DEmRNA）。
结果解读： CLL患者与健康对照间鉴定出57个差异表达mRNA（DEmRNAs）、335个差异表达miRNA（DEmiRNAs）；CLL细胞系与健康对照间鉴定出482个DEmRNAs、302个DEmiRNAs。差异RNA的热图显示CLL组与健康组表达谱显著区分（Fig 1A-B）。
产品关联： 细胞系购自ATCC（EHEB、293T）与加州大学圣地亚哥分校（MEC1）；RNA提取用TaKaRa RNAiso Plus，反转录用Accurate Biology试剂，qRT-PCR用SyberGreen（Accurate Biology）与Roche LightCycler 480II。

3.2 差异表达RNA的功能富集分析

实验目的： 探究DEGs的生物学功能，揭示CLL的分子机制。
方法细节： 对CLL患者与健康对照的DEmRNAs进行GO（基因本体）与KEGG（京都基因与基因组百科全书）分析，P<0.05为显著。
结果解读： GO分析显示DEmRNAs富集于“杂环化合物结合”（分子功能，如DNA结合蛋白）、“细胞器部分”（细胞组分，如染色质）、“基因表达调控”（生物过程）；KEGG分析富集于Notch信号通路、JAK-STAT信号通路（均与肿瘤发生发展密切相关，Fig 1C-D）。细胞系的DEmRNAs富集于mTOR、NF-κB通路与细胞周期（Supplementary Fig 1）。

3.3 预后风险评分模型的构建与验证

实验目的： 建立CLL患者的预后风险模型，用于临床风险分层。
方法细节： 使用GSE22762数据集（含CLL患者基因表达与临床数据），分为训练集、测试集、总集；通过单因素Cox回归筛选与总生存期（OS）相关的DEGs，LASSO回归避免过拟合，多因素Cox回归构建风险模型（风险评分=2.071×HTN3 + (-3.228)×IL3RA + (-1.847)×NCK1）；以训练集中位数风险分为界，将患者分为高/低风险组，验证模型的预测价值。
结果解读： 模型在训练集的一致性指数（C-index）为0.825，测试集0.719，总集0.773（提示预测准确性高）；ROC曲线下面积（AUC）分别为0.825（训练集）、0.719（测试集）、0.773（总集，Fig 2I、N、S）；高风险组OS显著短于低风险组（训练集P=0.010，测试集P=0.026，总集P=0.001，Fig 2H、M、R）；高风险组与del(13q14)染色体异常显著相关（Table 2）。

3.4 高低风险组的免疫特征分析

实验目的： 探究风险模型与CLL免疫微环境的关联。
方法细节： 用CIBERSORT算法分析22种免疫细胞浸润比例，ESTIMATE工具计算免疫评分（反映免疫细胞浸润）、基质评分（反映基质细胞含量）、ESTIMATE评分（综合免疫与基质评分）。
结果解读： 高风险组中性粒细胞比例更高，而B细胞 naive、CD8+T细胞、CD4记忆静止T细胞等浸润更低（Fig 3E）；高风险组基质评分（P<0.01）、免疫评分（无统计学意义）显著低于低风险组（Fig 3F）；免疫检查点分子（如BTLA、CD200、CD27）在高风险组表达更高（Fig 3G）——提示高风险患者免疫微环境更“抑制”，可能影响治疗反应。

3.5 ceRNA网络的构建

实验目的： 构建CLL患者中预后相关的ceRNA网络（lncRNA/circRNA-miRNA-mRNA）。
方法细节： 用miRanda与psRobot工具预测DElncRNA/DEcircRNA与DEmiRNA的结合，以及DEmiRNA与DEmRNA的结合；基于生存分析筛选与OS相关的DEGs，用Cytoscape软件可视化ceRNA网络。
结果解读： 构建了lncRNA-miRNA-mRNA网络（68个lncRNA节点、8个miRNA节点、3个mRNA节点，Fig 5）与circRNA-miRNA-mRNA网络（101个circRNA节点、8个miRNA节点、3个mRNA节点，Fig 6）；网络中的节点（如circ_0002078、miR-185-3p、TCF7L1）均与CLL预后相关。

3.6 关键ceRNA轴的验证

实验目的： 验证circ_0002078/miR-185-3p/TCF7L1轴的调控关系与功能。
方法细节：
1. 表达验证： qRT-PCR检测CLL患者与健康对照中circ_0002078、miR-185-3p、TCF7L1的表达；
2. 结合验证： 双荧光素酶报告基因实验——将含circ_0002078/TCF7L1野生型（WT）或突变型（Mut）3"UTR的质粒，与miR-185-3p mimics共转染293T细胞，检测荧光素酶活性；
3. 功能验证： CCK-8实验检测细胞增殖，Annexin V/7AAD检测凋亡，PI染色检测细胞周期。
结果解读：
- 表达差异： CLL患者中circ_0002078（P<0.05）、TCF7L1（P<0.05）高表达，miR-185-3p（P<0.05）低表达（Fig 7A-C）；
- 结合验证： 共转染circ_0002078-WT或TCF7L1-WT与miR-185-3p mimics时，荧光素酶活性显著降低（P<0.01），而突变型质粒无此效应（Fig 7H-I）——证实circ_0002078与TCF7L1直接结合miR-185-3p；
- 功能验证： 过表达miR-185-3p抑制MEC1细胞增殖（Fig 7J）；敲低circ_0002078（si-circ_0002078）抑制EHEB细胞增殖（Fig 7L）、促进凋亡（P<0.001，Fig 7M-N）、诱导G2/M期阻滞（Fig 7O-Q）——提示circ_0002078通过海绵miR-185-3p上调TCF7L1，促进CLL细胞增殖。

4. Biomarker研究及发现成果解析

Biomarker定位与筛选逻辑

本文涉及3类Biomarker：（1）风险模型基因（HTN3、IL3RA、NCK1）——通过RNA测序鉴定差异表达，结合Cox回归筛选预后相关基因；（2）miRNA（miR-324-3p）——通过临床队列分析与IGHV突变、p53突变、del17p的关联；（3）circRNA/mRNA（circ_0002078、TCF7L1）——通过ceRNA网络筛选，结合功能实验验证。

研究过程详述

1. 风险模型基因（HTN3、IL3RA、NCK1）：
2. 来源：GSE22762数据集的DEmRNAs；
3. 验证方法：多步Cox回归构建模型，在训练集、测试集、总集验证预测价值；

4. 性能：模型C-index为0.825（训练集）、0.719（测试集）、0.773（总集）；ROC曲线AUC为0.825~0.773；高风险组OS显著短于低风险组（总集P=0.001，Fig 2H、M、R）。

5. miR-324-3p：

6. 来源：CLL患者与健康对照的DEmiRNAs；
7. 验证方法：分析GSE40533与GSE45328队列中miR-324-3p与临床特征的关联；

8. 性能：miR-324-3p低表达与IGHV未突变（P<0.01）、p53突变（P<0.05）、del17p（P<0.01）相关（Fig 4M、Q、T）——提示miR-324-3p是CLL不良预后的潜在Biomarker。

9. circ_0002078与TCF7L1：

10. 来源：ceRNA网络中的关键节点；
11. 验证方法：qRT-PCR检测表达，双荧光素酶实验验证结合，功能实验验证表型；
12. 性能：circ_0002078高表达与短OS相关（P=0.031，Fig 7F），TCF7L1高表达与短首次治疗时间（TTFT）相关（P=0.009，Fig 7E）；二者表达呈正相关（r=0.743，P<0.001，Fig 7D）。

核心成果提炼

• 新型风险模型：包含HTN3、IL3RA、NCK1的风险评分模型，可精准预测CLL患者OS，高风险组与del13q14相关，为临床风险分层提供工具；
• 预后miRNA：miR-324-3p低表达提示CLL不良预后，与多种高危临床特征关联；
• 关键ceRNA轴：circ_0002078通过海绵miR-185-3p上调TCF7L1，促进CLL细胞增殖、抑制凋亡——为CLL的靶向治疗提供新靶点（如抑制circ_0002078或恢复miR-185-3p表达）。

图片插入（对应位置）

Fig 1：差异表达RNA的热图与功能富集分析

Fig 2：风险模型的构建与验证

Fig 3：高低风险组的免疫特征

Fig 4：miRNA与临床特征的关联

Fig 5：lncRNA-miRNA-mRNA ceRNA网络

Fig 6：circRNA-miRNA-mRNA ceRNA网络

Fig 7：circ_0002078/miR-185-3p/TCF7L1轴的验证

Fig 8：ceRNA轴的调控机制