1. 领域背景与文献引入
文献英文标题：Protein biomarkers in cervicovaginal lavages for detection of endometrial cancer；发表期刊：Biomarker Research；影响因子：未公开；研究领域：子宫内膜癌诊断；宫颈阴道灌洗液生物标志物；妇科肿瘤。
子宫内膜癌（EC）是高收入国家女性最常见的妇科恶性肿瘤，也是第四大常见癌症，全球发病率预计2040年将增长50%。其风险因素包括年龄增长、高BMI、代谢综合征、雌激素暴露等，但诊断环节仍存在关键痛点：现有金标准为子宫内膜活检或刮宫术，虽被视为“微创”，但仍会引发疼痛、焦虑及子宫穿孔等并发症，导致患者对早期检测的接受度低，尤其医疗资源不足人群更易延误诊断。
蛋白生物标志物是癌症诊断的重要方向，但传统血液或组织中的标志物（如HE4、CA125）因敏感性不足（单独或联合检测的敏感性约70%），难以满足临床需求。基于女性生殖道解剖连续性（子宫→宫颈→阴道），宫颈阴道灌洗液（CVL）作为微创样本，可能富集子宫内膜来源的蛋白，但此前仅少数研究利用宫颈液检测循环肿瘤DNA（如PapSEEK），CVL中的蛋白质生物标志物尚未系统研究。
本研究旨在填补这一空白：假设CVL中存在高浓度EC相关蛋白，通过量化其中72种免疫肿瘤蛋白，验证其作为EC诊断生物标志物的价值，并探索其与肿瘤严重程度的关联，为开发非/微创EC诊断方法提供依据。
2. 文献综述解析
文献综述以“EC流行病学→诊断痛点→现有生物标志物局限→CVL微创样本潜力”为核心逻辑，逐步引出研究问题：
- 关键结论：EC发病率上升但诊断方法有创，血液/组织蛋白标志物敏感性不足；CVL因解剖连续性可能含高浓度EC蛋白，且微创采样更易被接受，但CVL蛋白标志物研究空白。
- 现有研究局限性：① 诊断方法：子宫内膜活检/刮宫的有创性降低患者依从性；② 生物标志物：血液/尿液中的EC相关蛋白浓度低（尤其早期），难以检测；③ 样本类型：CVL作为微创样本，其蛋白标志物未被系统探索。
- 文献创新价值：① 首次系统分析CVL中的72种免疫肿瘤蛋白，明确其作为EC诊断生物标志物的潜力；② 结合多组学（PCA、层次聚类）与机器学习（LASSO+逻辑回归），构建高准确性的多标志物诊断模型；③ 首次关联CVL蛋白与EC肿瘤特征（如肌层浸润、MMR状态），为预后评估提供依据。
3. 研究思路总结与详细解析
整体框架
研究目标：量化CVL中免疫肿瘤蛋白，验证其作为EC诊断生物标志物的价值；核心科学问题：CVL蛋白能否区分EC与良性疾病，及与肿瘤严重程度的关联；技术路线：队列构建→样本收集→蛋白量化→谱分析→标志物筛选→模型构建→肿瘤关联，形成“假设-验证-结论”闭环。
3.1 研究队列构建与样本收集
实验目的：招募子宫切除患者，按病理分类疾病组并收集CVL样本。
方法细节：入组192例接受子宫切除的女性（良性疾病108例、子宫内膜增生18例、低级别子宫内膜样癌53例、其他EC亚型13例），疾病分类基于术后病理结果；术中用10ml生理盐水灌洗宫颈阴道，收集CVL样本，1小时内冻存于-80℃，避免反复冻融。
结果解读：队列中EC患者（低级别EEC、其他EC）年龄更大（平均58.7/60.8岁 vs 良性组45.6岁，n=192，P<0.0001）、BMI更高（平均40.3kg/m² vs 良性组30.6kg/m²，n=192，P<0.0001）、绝经后比例更高（76.5%/92.3% vs 良性组17.6%，n=192，P<0.0001）（表1）；所有CVL样本均成功检测72种蛋白。
实验所用关键产品：Milliplex MAP Magnetic Bead Immunoassays试剂盒（Human Cytokine Chemokine Panel 1、Human Circulating Cancer Biomarker Panel 1等，Millipore）、Bio-Plex 200仪器（Bio-Rad）、Human IL-36γ ELISA试剂盒（RayBiotech）。
3.2 全局蛋白谱分析
实验目的：比较不同疾病组、绝经状态、BMI的CVL蛋白谱差异。
方法细节：① 主成分分析（PCA）：将72种蛋白降维至前2个主成分（PC1、PC2），解释41.6%方差；② 层次聚类：基于Euclidean距离和Ward linkage，对样本进行聚类。
结果解读：① PCA显示疾病组（EC vs 良性）、绝经状态（绝经后 vs 绝经前）的蛋白谱显著差异（P<0.0001），但BMI无差异（P=0.33）（图1）；② 层次聚类将样本分为2个簇，簇1以良性患者为主（80%），簇2以EC患者为主（64%）（图2），提示EC患者的CVL蛋白谱与良性疾病显著不同。
3.3 单变量生物标志物筛选
实验目的：筛选能区分EC与良性疾病的CVL蛋白。
方法细节：① 线性混合模型：调整年龄、BMI后，比较组间蛋白水平；② 单变量ROC分析：计算AUC（AUC≥0.8为良好判别因子）。
结果解读：① 54种蛋白在低级别EEC中显著升高（P=0.05~<0.0001，Supplementary Table S3）；② 7种蛋白在EC中表现出良好判别能力：TIM-3（低级别EEC AUC=0.86、其他EC AUC=0.90）、IL-10（AUC=0.84/0.90）、TRAIL（AUC=0.82/0.90）、TGF-α（AUC=0.82/0.87）、CYFRA21-1（AUC=0.82/0.93）、VEGF（AUC=0.81/0.88）、TNFα（AUC=0.80/0.86）（图3）。
3.4 机器学习模型构建
实验目的：构建多生物标志物组合的EC预测模型，提高诊断准确性。
方法细节：① LASSO特征选择：筛选12种高频蛋白（CA19-9、CA125、eotaxin、G-CSF、IL-6、IL-10、MCP-1、MDC、TGF-α、TIM-3、TRAIL、VEGF）；② 逻辑回归+蒙特卡洛交叉验证：2/3样本训练，1/3样本测试，重复100次验证模型性能。
结果解读：模型AUC=0.91（图5B），平均准确性83.9%，敏感性86.1%，特异性87.9%（图5D）；5种蛋白（IL-10、TGF-α、TIM-3、TRAIL、VEGF）是关键判别因子，其组合显著提高了诊断准确性。
3.5 生物标志物与肿瘤特征关联
实验目的：分析CVL蛋白与EC严重程度的关联，探索其预后价值。
方法细节：① 提取病理特征：组织学类型（低级别EEC vs 其他EC）、肿瘤大小（≤2cm vs >2cm）、肌层浸润（有 vs 无）、MMR状态（缺陷 vs 正常）；② 火山图：校正False Discovery Rate（q<0.1）后，比较组间蛋白水平；③ Spearman相关：分析蛋白与肿瘤大小、肌层浸润深度的相关性。
结果解读：① 其他EC亚型中MCP-3显著升高（q<0.1）；② MMR缺陷型EC中VEGF显著升高（q<0.1）；③ 12种蛋白（fractalkine、HE4、IL-6等）与肿瘤大小（>2cm）相关，12种蛋白（TIM-3、VEGF等）与肌层浸润深度相关（图6）。
4. Biomarker 研究及发现成果解析
Biomarker 定位
类型：宫颈阴道灌洗液中的可溶性蛋白（免疫检查点蛋白：TIM-3；生长因子：VEGF、TGF-α；细胞因子：IL-10；凋亡相关蛋白：TRAIL等）。
筛选/验证逻辑：① 基于CVL样本的全局蛋白谱分析（PCA、层次聚类），确定EC与良性疾病的差异谱；② 单变量ROC筛选AUC≥0.8的蛋白；③ LASSO+机器学习构建多标志物组合，验证其诊断性能；④ 关联蛋白与肿瘤特征，探索预后价值。
研究过程详述
- 来源：术中收集的宫颈阴道灌洗液（10ml生理盐水灌洗，-80℃保存）。
- 验证方法：① 多重免疫分析：量化72种蛋白浓度；② 单变量ROC：评估单蛋白判别能力；③ 多变量逻辑回归：构建组合模型；④ 火山图+Spearman相关：分析与肿瘤特征的关联。
- 特异性与敏感性：① 单蛋白：TIM-3区分低级别EEC与良性的AUC=0.86，区分其他EC与良性的AUC=0.90；② 组合模型：12种蛋白的AUC=0.91，敏感性86.1%，特异性87.9%（n=192，P<0.0001）。
核心成果提炼
- 诊断价值：CVL中的TIM-3、VEGF、TGF-α等蛋白能有效区分EC与良性疾病，组合模型准确性高（AUC=0.91），优于单蛋白检测。
- 预后关联：TIM-3、VEGF与肿瘤大小、肌层浸润深度相关，VEGF与MMR状态相关，提示其可作为预后标志物，指导治疗监测。
- 创新性：首次发现宫颈阴道灌洗液中的蛋白质生物标志物可用于EC检测，微创采样结合多标志物组合解决了现有诊断方法的有创性问题，为医疗资源不足人群提供了早期检测的可能。
本研究为EC的微创诊断提供了新方向，未来需在更大样本队列中验证生物标志物，并探索自采样CVL（如月经杯）的可行性，进一步推动非侵入性EC诊断的临床转化。