1. 领域背景与文献引入
文献英文标题：Co-expression and clinical utility of AR-FL and AR splice variants AR-V3, AR-V7 and AR-V9 in prostate cancer；发表期刊：Biomarker Research；影响因子：未公开；研究领域：前列腺癌生物标志物。
前列腺癌是男性最常见的恶性肿瘤之一，雄激素受体（AR）是其发生发展的核心驱动因子。随着阿比特龙、恩扎卢胺等新型AR靶向药物（ARTA）的应用，转移性去势抵抗性前列腺癌（mCRPC）患者的生存期显著延长，但仍有20%~40%的患者对ARTA无响应，且缺乏有效的生物标志物预测治疗结局。AR剪接变体（AR-Vs）因缺乏配体结合域（LBD）、可 constitutively激活AR信号通路，被认为是ARTA耐药的关键机制之一。然而，现有研究对AR-Vs的临床价值存在争议：部分研究发现AR-V7阳性患者对ARTA无响应，另一部分研究则观察到此类患者仍有显著临床获益。此外，AR全长（AR-FL）与AR-Vs均源于同一AR前体mRNA（pre-mRNA），但两者的表达依赖关系及在不同疾病阶段的动态变化尚未完全阐明。
针对上述空白，本研究聚焦以下核心问题：①AR-FL与AR-V3、AR-V7、AR-V9的表达是否依赖AR pre-mRNA水平？②不同疾病阶段（原发、转移、mCRPC）中，AR-FL与AR-Vs的表达特征如何？③AR-FL与AR-Vs对mCRPC患者ARTA治疗的预测及预后价值如何？研究结果为理解AR-FL与AR-Vs的生物学关系及临床应用提供了关键证据。
2. 文献综述解析
现有研究围绕AR-Vs作为前列腺癌生物标志物展开，但存在三大局限：其一，多数研究仅关注单一AR-V（如AR-V7），未综合分析多种AR-Vs的协同作用；其二，对AR-FL与AR-Vs的表达依赖关系研究不足，缺乏细胞系与临床样本的联合验证；其三，临床队列样本量小，且未区分不同疾病阶段的表达差异。例如，部分研究仅在小样本mCRPC患者中分析AR-V7的预测价值，未纳入原发或转移组织样本；另有研究未考虑AR-FL水平对AR-Vs的影响，导致结果解读偏差。
本研究的创新点在于：①首次在细胞系与临床样本中系统验证AR-FL与AR-Vs的表达依赖关系——AR pre-mRNA水平升高时，AR-FL与AR-Vs的表达均显著增加；②综合分析AR-V3、AR-V7、AR-V9三种变体在原发肿瘤、转移组织及循环肿瘤细胞（CTC）中的表达特征，揭示疾病进展中两者的动态变化；③利用大样本mCRPC队列（n=65），明确AR-FL与AR-Vs的预后价值（AR-FL水平高提示总生存期短），但否定其预测价值（AR-Vs阳性患者仍对ARTA有响应）。
3. 研究思路总结与详细解析
3.1 细胞系中AR-FL与AR-Vs的表达依赖关系验证
实验目的：探究AR pre-mRNA水平升高对AR-FL与AR-Vs表达的影响。
方法细节：选取5种前列腺（癌）细胞系（健康上皮细胞RWPE-1、激素敏感型LNCaP、去势抵抗型22Rv1、神经内分泌分化型PC-3）及非前列腺细胞HEK293-T，通过两种方式升高AR pre-mRNA：①恩扎卢胺处理（10μM，最长14天）；②CRISPR/dCas9系统激活AR基因（转染AR启动子特异性gRNA或对照质粒）。提取总RNA后，用实时荧光定量PCR（qPCR）检测AR-FL（TaqMan assay：Hs00171172_m1）与AR-V3、V7、V9（定制TaqMan assay）的表达水平，以RPL37A和HPRT1为内参基因。
结果解读：恩扎卢胺处理后，LNCaP细胞的AR-FL水平显著升高（P<0.0001），同时AR-V3表达增加（P<0.001），AR-V7、V9轻微升高；22Rv1细胞（ARTA耐药）的AR-FL与AR-Vs无显著变化。CRISPR激活AR后，HEK293-T细胞的AR-FL水平升高，AR-V7、V9出现或增加（P<0.05）；PC-3与RWPE-1细胞（原本AR阴性）中，AR-FL与AR-Vs均首次检测到表达。结果表明，AR pre-mRNA水平是AR-FL与AR-Vs表达的共同驱动因素。
产品关联：实验所用关键产品包括Qiagen的RNeasy Mini Kit（RNA提取）、Takara的Primescript Reverse Transcription Kit（反转录）、Thermo Fisher的TaqMan PCR assay（基因检测）、Luna Mastermix（qPCR反应）及QuantStudio 3 qPCR仪（检测平台）。
3.2 临床组织样本中AR-FL与AR-Vs的表达分析
实验目的：分析原发与转移前列腺癌组织中AR-FL与AR-Vs的表达特征。
方法细节：收集10例原发前列腺癌组织与20例转移组织（淋巴结或骨转移），提取RNA后用qPCR检测AR-FL与AR-Vs的表达，以KLK3-PSA（前列腺特异性抗原）确认肿瘤细胞存在。
结果解读：AR-FL在所有组织样本中均阳性（100%）。原发组织中，AR-V7阳性率最高（95%），AR-V3（55%）、AR-V9（70%）次之；转移组织中，三种AR-Vs均100%阳性，且AR-FL与AR-Vs的表达水平显著高于原发组织（P<0.01）。结果提示，疾病进展中AR-FL与AR-Vs的表达同步升高。
产品关联：RNA提取使用Qiagen的RNeasy Mini Kit，反转录使用Qiagen的Quantitect Reverse Transcription Kit，qPCR试剂为Thermo Fisher的Luna Mastermix。
3.3 液体活检样本中AR-FL与AR-Vs的表达特征
实验目的：分析循环肿瘤细胞中AR-FL与AR-Vs的表达及与疾病进展的关系。
方法细节：纳入422例前列腺癌患者的外周血样本，用Dynabeads Epithelial Enrich Kit富集循环肿瘤细胞（CTC），提取mRNA后用qPCR检测KLK3-PSA（确认CTC阳性），再检测AR-FL与AR-Vs的表达。进一步分析96例mCRPC患者（不同治疗线）的CTC样本。
结果解读：73.7%的患者为CTC阳性，其中65.6%的CTC+样本同时表达AR-FL与AR-Vs。AR-Vs阳性样本的AR-FL水平显著高于AR-Vs阴性样本（P<0.0001），且AR-Vs数量越多（1种→3种），AR-FL水平越高（P<0.01）。随着治疗线数增加（一线→三线及以上），AR-FL与AR-Vs的阳性率从40%升至75%。结果表明，AR-Vs的表达依赖高AR-FL水平，且疾病进展中两者的表达同步增加。
产品关联：CTC富集使用Thermo Fisher的Dynabeads Epithelial Enrich Kit，mRNA提取使用Dynabeads mRNA DIRECT Purification Kit，反转录使用Thermo Fisher的SuperScript IV VILO Master Mix。
3.4 mCRPC患者ARTA治疗的临床结局分析
实验目的：分析AR-FL与AR-Vs对mCRPC患者ARTA治疗的预测及预后价值。
方法细节：纳入65例接受ARTA治疗（阿比特龙46例，恩扎卢胺19例）的mCRPC患者，检测基线CTC样本的AR-FL与AR-Vs表达，随访中位数14个月，分析与PSA响应（下降≥50%）、无进展生存期（PFS）、总生存期（OS）的关系。
结果解读：47.7%的患者出现PSA响应，其中CTC阴性患者的响应率最高（72.7%），CTC+AR-Vs阴性患者为52.6%，CTC+AR-Vs阳性患者为37.1%。AR-FL水平高的患者OS显著缩短（P<0.01），但AR-Vs阳性患者的PFS与AR-Vs数量无关（1种→3种的PFS均为5~6个月，P=0.96）。多因素分析显示，AR-FL与AR-Vs均无独立预测价值（P>0.05）。结果提示，AR-FL有预后价值，但AR-Vs无法预测ARTA响应。
产品关联：qPCR检测使用Thermo Fisher的TaqMan Fast Advanced Mastermix，其余试剂同前。
4. Biomarker研究及发现成果解析
Biomarker定位：本研究的生物标志物为AR-FL（雄激素受体全长）与AR-V3、AR-V7、AR-V9（雄激素受体剪接变体）。筛选逻辑为“细胞系验证表达依赖关系→组织样本验证疾病阶段特征→液体活检大样本验证→临床队列验证预后价值”，验证方法为qPCR（组织与液体活检样本）与CRISPR/dCas9（细胞系）。
研究过程详述：生物标志物的来源包括细胞系、原发/转移组织样本及外周血CTC。验证方法中，细胞系实验通过调控AR pre-mRNA水平，明确AR-FL与AR-Vs的表达依赖关系；组织样本与CTC样本通过qPCR检测，验证不同疾病阶段的表达特征。特异性方面，AR-Vs阳性样本均伴随高AR-FL水平，无单独AR-Vs阳性的样本；敏感性方面，AR-FL在CTC+样本中的阳性率高达92.9%（289/311）。
核心成果：①生物学关系：AR-FL与AR-Vs的表达依赖AR pre-mRNA水平，疾病进展中两者的表达同步增加；②临床特征：AR-Vs的表达总是伴随高AR-FL水平，无单独阳性样本；③预后价值：AR-FL水平高的mCRPC患者总生存期更短（P<0.01）；④预测价值：AR-Vs阳性患者仍对ARTA有响应（37.1%的PSA响应率），无独立预测价值。
（图1：AR-FL与AR-Vs的结构及实验设计。A：AR-FL（外显子1-8）与AR-V3、V7、V9的编码序列；B：实验设计概述，涵盖细胞系、组织样本与CTC分析）
（图2：细胞系中AR-FL与AR-Vs的表达依赖关系。A：恩扎卢胺处理LNCaP细胞后，AR-FL与AR-V3水平显著升高；B：CRISPR激活AR后，HEK293-T细胞的AR-V7、V9表达增加；C：PC-3与RWPE-1细胞激活AR后，AR-FL与AR-Vs首次检测到表达）
（图3：组织样本中AR-FL与AR-Vs的表达。A：原发组织中AR-V7阳性率最高；B：转移组织中三种AR-Vs均100%阳性；C：转移组织的AR-FL与AR-Vs水平显著高于原发组织）
（图4：CTC样本中AR-FL与AR-Vs的表达。A：CTC+样本中65.6%同时表达AR-FL与AR-Vs；B：AR-Vs数量越多，AR-FL水平越高；C：AR-FL与AR-Vs水平呈强正相关）
（图5：不同治疗线的AR-FL与AR-Vs表达。随着治疗线数增加，AR-FL与AR-Vs的阳性率从40%升至75%）
（图6：AR-FL与AR-Vs对临床结局的影响。A：54%的患者为CTC+AR-Vs阳性；B：AR-Vs阳性患者仍有37.1%的PSA响应；C：AR-Vs数量不影响无进展生存期；D：AR-FL水平高的患者总生存期更短）