1. 领域背景与文献引入
文献英文标题：Single-cell multi-omics analysis identifies SPP1+ macrophages as key drivers of ferroptosis-mediated fibrosis in ligamentum flavum hypertrophy；发表期刊：Biomarker Research；影响因子：未公开；研究领域：脊柱退行性疾病（黄韧带肥厚纤维化机制研究）
黄韧带肥厚（LFH）是腰椎管狭窄（LSS）的主要病因之一，全球每年约1.03亿人受LSS相关症状困扰，严重影响生活质量并造成沉重的社会经济负担。现有研究已明确机械应力、慢性炎症、氧化应激是LFH纤维化进展的核心诱因，证实成纤维细胞向肌成纤维细胞转化是纤维化的细胞学基础，巨噬细胞浸润参与炎症信号激活，但LFH发生发展的细胞异质性及深层分子调控机制仍未完全阐明。近年来，单细胞转录组技术成为解析纤维化微环境细胞图谱的热点方向，但铁死亡（ferroptosis）这一铁依赖性非凋亡细胞死亡方式在LFH中的作用尚未被揭示，巨噬细胞亚群与成纤维细胞铁死亡的调控关系也缺乏系统研究。针对上述研究空白，本研究通过整合单细胞RNA测序（scRNA-seq）、bulk RNA测序、孟德尔随机化（MR）及临床/动物模型验证，系统解析LFH的纤维化微环境，揭示铁死亡及SPP1+巨噬细胞在LFH中的关键调控作用，为LFH的诊断和治疗提供新的靶点。
2. 文献综述解析
作者从细胞类型异质性、分子机制、技术方法三个维度对LFH领域现有研究进行分类评述，系统梳理了成纤维细胞转化、巨噬细胞浸润、机械应力与炎症信号通路等核心研究方向的进展与局限性。
现有研究的关键结论集中在成纤维细胞功能异常与纤维化的关联，证实成纤维细胞在机械应力刺激下可分化为肌成纤维细胞，大量分泌胶原蛋白等细胞外基质（ECM）成分，推动LFH进展；同时，巨噬细胞浸润被认为是LFH炎症反应的核心触发因素，可通过分泌细胞因子激活成纤维细胞。技术方法层面，传统bulk测序可揭示整体基因表达变化，动物模型（如双足站立小鼠模型）可模拟LFH的机械应力诱因，但这些方法无法解析细胞水平的异质性，难以区分不同细胞亚群的功能差异。现有研究的局限性主要体现在三个方面：一是缺乏单细胞水平的LFH细胞图谱，无法明确成纤维细胞、巨噬细胞等细胞的亚群功能异质性；二是未关注铁死亡这一新型细胞死亡方式在LFH中的作用，铁代谢紊乱与LFH的因果关系尚未验证；三是巨噬细胞亚群与成纤维细胞的具体调控通路仍不明确，缺乏多组学整合的系统分析。本研究的创新价值在于首次将单细胞多组学与孟德尔随机化结合，解析LFH的铁死亡调控机制，鉴定出SPP1+巨噬细胞这一新型促纤维化亚群，揭示其通过SPP1-CD44轴调控成纤维细胞铁死亡的分子通路，填补了LFH领域在细胞异质性与铁死亡机制研究中的空白。
3. 研究思路总结与详细解析
本研究的整体研究目标是系统解析LFH纤维化的细胞异质性与分子调控机制，核心科学问题是铁死亡如何参与LFH纤维化进程，以及巨噬细胞亚群对成纤维细胞铁死亡的调控作用，技术路线遵循“临床样本单细胞图谱构建→多组学整合分析铁死亡机制→孟德尔随机化验证因果关系→临床与动物模型功能验证→细胞互作通路解析”的闭环逻辑，通过多维度实验验证揭示SPP1+巨噬细胞的关键驱动作用。
3.1 临床样本收集与单细胞RNA测序实验
实验目的是构建正常与肥厚黄韧带组织的单细胞转录组图谱，解析LFH中的细胞组成与比例变化。方法细节：本研究共纳入26例临床样本，其中13例腰椎间盘突出症（LDH）患者的非LFH黄韧带组织（厚度≤3.74mm），13例腰椎管狭窄（LSS）患者的LFH组织（厚度>3.74mm）；选取其中10例样本（5例非LFH、5例LFH）进行scRNA-seq，采用BD Rhapsody™ Express单细胞分析系统分离单细胞，合成cDNA并构建文库，经Agilent 2100 Bioanalyzer和Qubit Fluorometer质控后，用Illumina HiSeq X Ten测序仪完成测序；测序数据经Seurat软件预处理，过滤低质量细胞后保留21301个细胞进行聚类分析。结果解读：UMAP聚类分析得到21个细胞簇，共鉴定出16种主要细胞类型，其中成纤维细胞、肌成纤维细胞、巨噬细胞在LFH组中的比例显著高于非LFH组（成纤维细胞占比从55.5%升至62.3%，巨噬细胞占比从2.7%升至3.1%，n=5，P<0.05），提示这些细胞类型在LFH纤维化中发挥核心作用。实验所用关键产品：BD Rhapsody™ Express单细胞分析系统、BD Human Single-Cell Multiplexing Kit（#633781）、BD Rhapsody Whole Transcriptome Analysis（WTA）Reagent Kit（#633801）、Agilent 2100 Bioanalyzer、Qubit dsDNA HS Assay Kit（#Q32854）、Illumina HiSeq X Ten测序仪。
3.2 铁死亡在LFH中的作用验证
实验目的是验证铁死亡是否为LFH纤维化的风险因素，并明确其分子特征。方法细节：对临床样本进行组织学染色（EVG、Masson）和透射电镜（TEM）观察，检测铁离子水平；通过单细胞基因集评分分析ROS和脂质代谢通路活性；采用孟德尔随机化（MR）分析铁代谢紊乱与LFH的因果关系（因LFH无GWAS数据，用脊柱管狭窄（SCS）替代）。结果解读：组织学染色显示LFH组弹性纤维比例显著降低（从78.2%降至32.5%，n=5，P<0.001），胶原蛋白比例显著升高（从21.8%升至67.5%，n=5，P<0.001）；TEM观察到LFH组线粒体出现铁死亡特征性改变：线粒体皱缩、膜密度增加、嵴减少或消失；铁离子水平检测显示LFH组铁离子含量显著高于非LFH组（n=5，P<0.05）；单细胞基因集评分显示LFH组ROS评分（P<0.05）和脂质代谢评分（P<0.0001）显著高于非LFH组；MR分析采用逆方差加权（IVW）法，结果显示铁代谢紊乱与SCS存在正因果关系（OR=1.01，95%CI 1.00-1.01，P=0.046），敏感性分析证实结果稳定无异质性。实验所用关键产品：Ferrous Ion Content Assay Kit（BC5415，Solarbio）、Tecnai G2 Spirit透射电镜、EVG染色试剂盒（B1053，Baiqiandu）、Masson三色染色试剂盒（B1011，Baiqiandu）。
3.3 成纤维细胞亚群功能异质性与铁死亡分析
实验目的是解析成纤维细胞亚群的功能差异，明确铁死亡与成纤维细胞功能的关联。方法细节：对成纤维细胞（含肌成纤维细胞）进行亚群聚类，得到8个亚群；通过GO富集、GSVA、scMetabolism分析各亚群的功能与代谢通路活性；基于铁死亡促进/抵抗基因表达进行铁死亡评分，将成纤维细胞分为高、低、无显著铁死亡评分三类。结果解读：8个成纤维细胞亚群分别为受损成纤维细胞（DamFB）、稳态相关成纤维细胞（HomFB）、结构成纤维细胞（StrFB）、软骨形成成纤维细胞（ChoFB）、炎症相关成纤维细胞（InfFB）、修复相关成纤维细胞（RepFB）、肌成纤维细胞（MyoFB）、免疫相关成纤维细胞（ImmFB）；铁死亡评分显示DamFB和RepFB中高铁死亡评分成纤维细胞（High Ferro-score FB）占比最高（分别为42.3%和38.7%）；代谢通路分析显示DamFB的铁死亡促进通路（如α-亚麻酸代谢、亚油酸代谢）活性最高，而铁死亡抵抗通路（如谷胱甘肽代谢、脂肪酸降解）活性最低；伪时间分析显示成纤维细胞从StrFB分化为DamFB，LFH组中铁死亡促进基因表达随伪时间持续升高，而铁死亡抵抗基因表达持续降低（n=5，P<0.001）。
3.4 巨噬细胞亚群鉴定与功能分析
实验目的是解析单核吞噬细胞的亚群异质性，鉴定LFH中富集的巨噬细胞亚群并分析其功能。方法细节：对单核吞噬细胞（包括单核细胞、巨噬细胞、树突状细胞等）进行重新聚类，得到8个亚群；通过GSVA分析各亚群的功能通路，结合免疫组化（IHC）验证关键标志物的表达。结果解读：鉴定出SPP1+巨噬细胞（SPP1+ Mac）这一亚群，在LFH组中的比例显著高于非LFH组（从12.5%升至32.7%，n=5，P<0.001）；功能分析显示SPP1+ Mac表现为M2型巨噬细胞表型，高表达CD163、MRC1（CD206）等M2标志物，富集纤维化相关通路（如ECM结合、胶原蛋白结合）及铁代谢通路（如铁离子转运、亚铁结合）；IHC验证显示LFH组SPP1、CD206的阳性表达率显著高于非LFH组（SPP1：18.2% vs 45.6%，n=5，P<0.001；CD206：22.3% vs 51.2%，n=5，P<0.01）。
3.5 细胞互作与调控机制验证
实验目的是解析SPP1+巨噬细胞与成纤维细胞的互作通路，验证其对成纤维细胞铁死亡的调控作用。方法细节：用CellChat软件分析LFH与非LFH组的细胞通讯网络，筛选关键配体-受体对；通过多重免疫荧光验证SPP1与CD44的共定位，以及铁死亡和纤维化标志物的表达；在双足站立（BS）小鼠模型中验证上述结果。结果解读：CellChat分析显示LFH组细胞通讯网络更复杂，SPP1+巨噬细胞的传入/传出通讯强度显著高于IL1B+巨噬细胞，成为LFH中的主要信号调控细胞；关键配体-受体对分析显示SPP1-CD44轴是SPP1+巨噬细胞与High Ferro-score FB的核心互作通路，LFH组中该通路的通讯概率显著升高（P<0.0001）；多重免疫荧光显示LFH中SPP1与CD44共定位区域伴随COL1沉积增加（P<0.001）和FTL（铁死亡抵抗基因）表达降低（P<0.001）；BS小鼠模型验证显示，模型组铁死亡标志物ACSL4表达升高（P<0.001），GPX4、FTL表达降低（P<0.001），纤维化标志物COL1、FN1、α-SMA表达显著升高（P<0.001），与临床样本结果一致。实验所用关键产品：SPP1抗体（#PB0589，Boster）、CD44抗体（#15675-1-AP，proteintech）、COL1抗体（#AF7001，Affinity）、FTL抗体（#DF6604，Affinity）。
3.6 bulk RNA-seq与去卷积分析
实验目的是扩大样本量验证单细胞测序结果，明确细胞比例变化与基因表达的关联。方法细节：收集6例样本（3例非LFH、3例LFH）进行bulk RNA-seq，结合GEO数据集GSE113212（4例LFH、4例非LFH），去除批次效应后进行差异表达分析；用BayesPrism工具进行去卷积分析，推断细胞比例变化；通过Spearman相关分析细胞类型的关联。结果解读：差异表达分析共鉴定出711个差异基因，其中544个上调、167个下调，富集通路包括纤维化（胶原蛋白结合、ECM组装）、铁代谢（铁离子转运）、巨噬细胞分化（巨噬细胞分化正调控）；去卷积分析显示LFH组成纤维细胞和巨噬细胞比例升高，Spearman相关分析显示成纤维细胞与巨噬细胞呈显著正相关（P<0.05），证实两者在LFH纤维化中的协同作用。
4. Biomarker研究及发现成果解析
本研究鉴定出两类与LFH纤维化相关的Biomarker：一是细胞型Biomarker——SPP1+巨噬细胞，二是分子型Biomarker——铁死亡相关基因（GPX4、FTL、ACSL4），通过“单细胞筛选→临床样本验证→动物模型验证→孟德尔随机化因果分析”的完整逻辑链条，证实其在LFH中的诊断与预后价值。
Biomarker定位方面，SPP1+巨噬细胞是LFH中富集的促纤维化巨噬细胞亚群，筛选逻辑为：通过scRNA-seq在单核吞噬细胞中鉴定出SPP1高表达的亚群，经bulk RNA-seq去卷积分析验证其比例在LFH中升高，再通过IHC和多重免疫荧光验证其与纤维化的关联；铁死亡相关基因（GPX4、FTL、ACSL4）作为分子Biomarker，筛选逻辑为：通过单细胞基因集评分发现铁死亡通路在LFH中富集，经临床样本IHC、Western blot验证其表达变化，动物模型进一步确认其与纤维化的关联。研究过程详述：SPP1+巨噬细胞来源于临床黄韧带组织，验证方法包括scRNA-seq、IHC、多重免疫荧光，其特异性表现为仅在LFH组织中显著富集，敏感性为LFH组比例是非LFH组的2.6倍（n=5，P<0.001）；铁死亡相关基因的验证方法包括IHC、Western blot，其中GPX4在LFH组的表达水平为非LFH组的0.4倍（n=3，P<0.001），FTL为0.3倍（n=3，P<0.001），ACSL4为2.1倍（n=3，P<0.001）；ROC曲线数据文献未明确提供，无法评估其诊断效能。核心成果提炼：SPP1+巨噬细胞作为LFH的新型促纤维化Biomarker，其功能关联为通过SPP1-CD44轴调控High Ferro-score FB的铁死亡，驱动纤维化进程，创新性在于首次在LFH中发现该巨噬细胞亚群的调控作用；铁死亡相关基因作为功能Biomarker，证实铁死亡是LFH的风险因素，孟德尔随机化分析显示铁代谢紊乱与LFH的风险比HR=1.01（95%CI 1.00-1.01，P=0.046）；这些Biomarker为LFH的早期诊断和靶向治疗提供了新的候选靶点，具有重要的临床转化价值。
