人精切肝切片中胆管细胞激活的体外建模方案
作者：Beatrice Anfuso, Manuela Mastronardi, Silvia Palmisano, Giovanni Sorrentino（意大利的里雅斯特大学 / ICGEB）
期刊：STAR Protocols ｜ DOI：10.1016/j.xpro.2026.104815 ｜ PMC：PMC13571306 ｜ 发表：2026-09（接收 2026-09-17）
说明：中文编译版供学习交流，实验设计请以原文为准。
1. 背景与创新点
持续性胆管反应（ductular reaction, DR）是慢性肝损伤的标志：反应性胆管上皮细胞（biliary epithelial cells, BEC）大量增殖并表现促炎活性。PCLS 长期用于研究肝细胞代谢和药物毒性，但用来建模 DR 的报道一直很少。本方案的四个关键改进：
- niche 扩增培养基 + BME 包埋：在保留天然细胞外基质与汇管区空间组织的同时，支持反应性 BEC 激活与增殖，上皮–基质–免疫互作保全；
- AI 数字病理定量：StarDist 自动核分割 + QuPath 监督分类器，比人工计数更可重复、可规模化；
- 兼容化合物筛选：原始研究借此发现反应性 BEC 对甲羟戊酸代谢的通路依赖；
- 适用面广：小鼠/人肝组织、健康与病变肝（脂肪变性、胆汁淤积、纤维化）均可用。
2. 培养基配方
表 1：基础 William's E 培养基（50 mL，取样前 24 h 内新鲜配制，4°C）
| 试剂 | 终浓度 | 储液浓度 | 用量 |
|---|---|---|---|
| William's E 培养基（无谷氨酰胺） | — | — | 48.5 mL |
| L-谷氨酰胺 | 2 mM | 200 mM | 0.5 mL |
| 葡萄糖 | 15 mM | N/A | 137 mg |
| HEPES | 10 mM | 1 M | 0.5 mL |
| 青/链霉素 | 1% | N/A | 0.5 mL |
注：终葡萄糖浓度 25 mM（原配方含糖 + 补充糖）；先加葡萄糖搅至完全溶解，0.22 μm 滤器过滤后再无菌加入其余组分。
表 2：扩增培养基（50 mL，4°C 可存 ≤2 周）
| 试剂 | 终浓度 | 储液浓度 | 用量 |
|---|---|---|---|
| 基础 William's E 培养基 | — | — | 47.55 mL |
| B27 | 1:50 | N/A | 1 mL |
| N2 | 1:100 | N/A | 0.5 mL |
| 烟酰胺 | 10 mM | 1 M | 0.5 mL |
| N-乙酰半胱氨酸（NAC） | 1 mM | 1 M | 50 μL |
| [Leu15]-胃泌素 I | 10 nM | 50 μM | 10 μL |
| EGF | 50 ng/mL | 50 μg/mL | 50 μL |
| FGF-10 | 100 ng/mL | 100 μg/mL | 50 μL |
| HGF | 25 ng/mL | 50 μg/mL | 50 μL |
| R-spondin-1 | 1 μg/mL | 1 mg/mL | 50 μL |
| Forskolin | 10 μM | 10 mM | 50 μL |
| A83-01 | 5 μM | 5 mM | 50 μL |
| Noggin | 25 ng/mL | 25 μg/mL | 50 μL |
| Wnt-3a | 50 ng/mL | 50 μg/mL | 50 μL |
主要抗体与关键试剂
| 试剂 | 来源 / 货号 |
|---|---|
| CK7 抗体（BEC 标记，1:50） | Santa Cruz sc-23876; RRID: AB_2265604 |
| anti-mouse IgG Alexa Fluor 594（1:200） | Jackson 115–585–062; RRID: AB_2338876 |
| Cultrex BME Type 2 | BioTechne 3533–010–02 |
| Click-iT EdU 细胞增殖试剂盒 | Thermo Fisher C10337 |
| ReadyProbes 自发荧光淬灭试剂盒 | Invitrogen R37630 |
| 低熔点琼脂糖（3% w/v 用于包埋） | Sigma-Aldrich A4018 |
| Alabama MD6000 精密切片机 | TSE Systems（振动切片机可替代） |
| 8 μm 聚碳酸酯 Transwell 插嵌 + 24 孔板 | Costar 3422 / 3526 |
| QuPath v0.5.1 + StarDist 扩展 | 开源（qupath.github.io） |
3. 开始之前
试剂预准备（1–2 h）：① 配基础培养基；② 每个样本备一支含 15 mL 基础培养基的 50 mL 管（4°C）；③ 两块 6 孔板各孔加 2 mL 基础培养基——一块放冰上（切片临时存放），一块进 37°C/5% CO₂ 培养箱（恢复培养）；④ 备无菌 PBS（4°C）；⑤ BME 冰上缓慢解冻、全程冰上操作（防过早聚合与气泡）；⑥ 配 3% 低熔点琼脂糖（1.5 g + 50 mL PBS，微波低火溶化，37°C 水浴保温）。
切片工作站搭建（20 min，生物安全柜内）：组装切片机（每场实验换新刀片）；切割前即刻注入 400 mL 无菌冷 PBS（长时间切割建议配外置制冷单元；KHB 缓冲液可替代 PBS）；切割板、包埋管、压杆工具冰上预冷；打孔器、收集勺、镊子、手术刀灭菌。小鼠肝 PCLS 制备详见 Anfuso et al. (2025)。
4. 分步方案
步骤 1｜人肝样本采集（1 h）
减重手术主要操作开始前，主刀医师于左叶游离缘腹腔镜下取约 1.5 × 2 cm 肝活检。研究者手术室外待命；组织离体后术者立即分两份：一份送病理常规评估，一份用于研究。研究用组织块立即放入冰冷基础培养基的 50 mL 管，4°C 转运。
步骤 2｜精切肝切片制备（30 min–1 h）
- 组织置于无菌切割板，吸水纸吸干。
- 5 mm 活检打孔器垂直组织面打出圆柱形组织芯。CRITICAL：避开电凝区和包膜边缘。
- 琼脂糖包埋：组织芯置于冰冷包埋管中央 → 倒入 37°C 琼脂糖（高出组织约 1 cm）→ 插入压杆压实 → 室温凝固 3–5 min。组织块太小时可整块包埋直接切，再从切片上打孔取得标准化圆形切片。1.7 cm 高的楔形活检通常得 2–3 个组织芯；每个 5 mm 高的组织芯约切 10–15 张切片。
- 取出琼脂糖块装上切片机，设定厚度 260 μm，启动自动切割。人肝经验参数：arm speed 2、blade speed 4；PBS 流速以切片能自由漂浮又不受伤为宜。
- 松开夹钳，切片随缓冲液冲入无菌烧杯，用收集勺转入含冰冷基础培养基的 6 孔板（每孔 ≤8–10 张；不同组织芯分孔、保留溯源）。
- 全部切完后转入预热培养基，37°C 摇床恢复 2 h。切片机用后立即去离子水冲洗。
步骤 3｜PCLS 铺板与 BME 包埋（2 h）
- 每张切片准备一个 8 μm 孔径 Transwell 插嵌，放入配套 24 孔板。
- BME 用冰冷基础培养基 1:3 稀释，每插嵌备 70 μL，保持冰上。
- 每插嵌加 35 μL 稀释 BME，37°C 固化约 30 min。CRITICAL：BME 铺展均匀、无气泡——气泡阻碍营养扩散。
- 无菌毛刷将切片移入插嵌，轻摊平使其与 BME 层充分接触。CRITICAL：不带入过多液体；不触碰 BME 层。
- 切片上再覆盖 35 μL 稀释 BME，37°C 固化约 30 min。
- 孔底加 600 μL 扩增培养基（预热 37°C，防 BME 融化），插嵌内加 100 μL。37°C、5% CO₂ 培养。
- 每日手动枪头换液，轻柔操作不碰 BME 层；禁用真空抽吸（会破坏 BME、冲走切片）。
步骤 4｜EdU 掺入检测 BEC 增殖（每条件 ≥3 张切片）
- 收片前 24 h 新鲜配制含 10 μM EdU 的扩增培养基。
- 换含 EdU 培养基：孔内 0.6 mL + 插嵌内 0.1 mL。CRITICAL：吸插嵌内液体时勿触碰 BME 层。
- 24 h 后吸去培养基，冰冷 PBS 充满孔与插嵌；冰上 4°C 轻摇 15 min 溶解 BME。
- 去 BME，切片移入 10% 中性福尔马林，4°C 固定 12–16 h（24/48 孔板固定防折叠）。
- 标准流程制石蜡块：脱水透明时切片夹在两块纱布/活检海绵之间防折叠；每张 PCLS 单独包埋（约 7 × 7 mm 小蜡块），切片平贴模具底、快速冷却防移位。
- 切 5 μm 石蜡切片裱片；多条件可同片并行，但须标注位置。
- 免疫荧光：抗原修复 + 封闭 → CK7 一抗 4°C 湿盒 12–16 h → 次日二抗 → Click-iT 反应混合液 30 min → ReadyProbes 淬灭自发荧光 5 min（可用 Sudan Black B 替代）→ DAPI 复染封片。
- 数字切片扫描仪扫描（如 ZEISS Axioscan 7）；无扫描仪时每条件至少拍 5 个含汇管区的代表性视野。
步骤 5｜QuPath 数字定量增殖 BEC
- 新建 QuPath 项目，导入全片扫描，确认通道分配。
- 核分割：圈选分析区域，在 DAPI 通道运行 StarDist，生成单细胞对象。
- 训练分类器：圈选代表性"训练"区；EdU 强度取核区室、CK7 强度取胞质/全细胞；按强度组合指派表型（CK7⁺/CK7⁻ × EdU⁺/EdU⁻）。CRITICAL：训练区必须覆盖所有表型（含阴性）与不同荧光强度；可多区域训练提升稳健性。
- 批量表型：分类器应用到全部图像 → 得总 CK7⁺（总 BEC）与 CK7⁺/EdU⁺（增殖 BEC）。
- 计算：% 增殖 BEC = CK7⁺/EdU⁺ 细胞数 ÷ 总 CK7⁺ 细胞数 × 100（多视野先汇总细胞数再算）。以独立实验均值 ± SD 报告——每位患者是独立生物学重复。
5. 预期结果
扩增培养基中，PCLS 的 BEC 随时间逐步激活；切片可支持 BEC 激活长达 8 天（因组织特征而异）。增殖 BEC 通常富集于汇管区周围，呈不规则迁移样形态。除 BEC 增殖外，平台还能评估 Vimentin⁺ 成纤维细胞 / α-SMA⁺ 肌成纤维细胞增殖（EdU 或 Ki67）、多重免疫荧光空间蛋白质组、单细胞/单核 RNA 测序；天然 ECM 保留允许 SHG 显微镜做结构定量、AFM/纳米压痕做力学表征。原研究借此发现反应性 BEC 对甲羟戊酸代谢的依赖。
6. 局限性
- 扩散梯度：260 μm 切片长时间培养可能出现氧/营养梯度，局部缺氧难避免；
- 个体差异：人源 PCLS 变异大（年龄、代谢状态、脂肪变性、炎症、缺血时间），每位供体独立重复、需足够样本量；
- 外源基质：BME 引入外源成分与残留生长因子；改用 GelMA/PEG 水凝胶需重新优化；
- EdU 读出：反映标记窗口内累积增殖，不区分周期动力学；可补 Ki67 或 pHH3。
7. Troubleshooting 速查
| 问题 | 解决方案 |
|---|---|
| 切片活性低 / BEC 无激活 | 离体 1 h 内处理、全程冰上；正式实验前用 CellTiter-Glo（ATP）或 MTS 先测切片活性。 |
| 切片不规则、不完整、厚薄不均 | 按组织质地调刀臂/刀速；过软提高琼脂糖浓度、过硬降速；MD6000 可配专用夹持器免琼脂糖切割。 |
| EdU 信号弱或不稳定 | 优化脉冲时长（16–24 h）与浓度；固定勿超 16 h；背景高先淬灭；工作液现配、储液分装防冻融。 |
| QuPath 背景高 / 表型不准 | 保证图像质量、切片折叠破损即重染；训练区覆盖阴阳细胞与强度梯度；批量分析前目检核分割。 |
| 重复间/样本间变异大 | 连续切片在处理组间均匀分配；增加切片数；每位患者独立重复，严禁跨供体合并。 |
8. 资源与联系
Lead contact：Giovanni Sorrentino（giovanni.sorrentino@units.it）；技术联系人：Beatrice Anfuso（beatrice.anfuso@icgeb.org）。本方案依赖新鲜原代组织，无新增材料。
利益声明：G.S. 与 B.A. 为意大利专利 no. 102024000007321 发明人。执行任何实验方案须遵守当地机构实验室安全与伦理规范。
本文为 STAR Protocols 论文的中文编译版，仅供学习交流：DOI 10.1016/j.xpro.2026.104815