STAR PROTOCOLS · 每日一篇 · 第 009 期
看清基因"呼吸"的节奏：smFISH + 活细胞成像测转录爆发，评估内分泌干扰物影响
这篇方案解决什么问题
基因表达不是"匀速流水线"，而是一阵一阵地"爆发"（transcriptional bursting）——基因时而开启批量转录、时而关闭静默，爆发大小与频率共同决定 mRNA 产量。雌激素应答基因 TFF1 是研究这一现象的经典模型，而内分泌干扰物（EDCs）恰恰可能在不引起明显毒性的浓度下改变爆发的节奏。
来自 NIH/NIEHS Rodriguez 实验室的这套方案，把两种互补手段拧成一条线：固定细胞 smFISH 快速、便宜，给出大样本的绝对 RNA 拷贝数与转录位点强度（稳态参数）；活细胞 MS2 成像捕获单个等位基因爆发的起始、时长与频率（动态参数）。两套数据纳入统一动力学模型，就能区分"活性等位基因比例变了"还是"爆发起始频率变了"这两种机制。
整体流程一览
- 准备：TFF1-MS2 报告细胞系（24× MS2 茎环敲入 3′UTR，构建需 3–6 个月）、smFISH 探针（外显子 Quasar 570 + 内含子 Quasar 670）、去激素培养条件；
- 剂量-响应处理（8–9 天）：E2 七个浓度（10⁻¹³–10⁻⁷ M）或 EDC 六个浓度（10⁻⁹–10⁻⁴ M）；
- 固定通透 + smFISH 杂交成像：定量转录位点数量与强度；
- 活细胞 MS2 成像：约 14.2 h 长时程拍摄，TrackMate/Localize 追踪单细胞；
- HMM 拟合：提取 ON/OFF 时长，画累积分布；
- 两套数据整合：区分爆发大小 / 活性等位基因比例 / 起始频率的变化。
实验前准备
- 报告细胞系：MCF-7-TFF1-MS2（Rodriguez 等构建），表达 MS2 外壳蛋白-GFP 融合体（MCP-GFP）可视化新生转录本；
- 去激素培养：无酚红 MEM + 活性炭/葡聚糖处理 FBS，配体处理前先去激素达稳态；
- 探针：18–22 bp 探针组，双荧光标记（序列见原文 Table S1）；
- 配体稀释（15 min）：从 10⁻³ M E2 母液或 1 M EDC 母液做 10 倍系列稀释，每个稀释度另加 0.5–1 mL 余量。NOTEE2 在约 1 nM 饱和（EC₅₀ ≈ 0.018 nM），EDC 需约 10 μM 才达到相当反应强度。
关键材料与试剂
| 试剂 | 来源 | 货号 |
|---|---|---|
| 17-β-雌二醇（E2） | Sigma-Aldrich | E2758 |
| 甲酰胺（99.5%）/ 20× SSC | Thermo Fisher / Quality Biological | BP228-100 / 351-003-131 |
| 硫酸葡聚糖钠盐 | Sigma-Aldrich | D8906 |
| ProLong Gold 抗淬灭封片剂（含 DAPI） | Thermo Fisher | P36935 |
| 18 mm #1.5 盖玻片 | EMS | 72222-01 |
| MEM / 无酚红 MEM | Thermo Fisher | 10370 / 51200 |
| FBS / 活性炭-葡聚糖处理 FBS | Sigma-Aldrich | F2442 / F6765 |
| 多聚甲醛（32% 水溶液） | EMS | 15714-S |
| MCF-7 细胞 | ATCC | HTB-22 |
主要软件：CellProfiler 3.1.9 + Spyder（smFISH 分析）、Fiji + TrackMate（核追踪）、Localize（MS2 斑点分割追踪）、自定义 Python 流程（GitHub: singlecelldynamics/AcuteBPA，已存档 Zenodo）。
主要仪器：ASI RAMM 或 Andor Dragonfly 转盘共聚焦 + HILO，Hamamatsu ORCA-Flash4 V3 或 Andor iXon Life 888，40× 水浸 / 60× 油浸物镜，Oko Lab 培养舱，NUNC Lab-Tek II 双腔室玻底皿。
试剂配方表
| 溶液 | 组分与终浓度 |
|---|---|
| 完全培养基（500 mL） | MEM 定容 + FBS 10% + 谷氨酰胺 2 mM + 青-链霉素 1× |
| 去激素培养基（500 mL） | 无酚红 MEM 定容 + 活性炭/葡聚糖 FBS 10% + 谷氨酰胺 2 mM + 青-链霉素 1× |
| 4% PFA 固定液（12 mL） | 32% PFA 1.5 mL + 1× RNase-free PBS 10.5 mL |
| 通透液（12 mL） | 无水乙醇 8.4 mL + 无核酸酶水 3.6 mL（70%） |
| 杂交缓冲液（50 mL） | 硫酸葡聚糖 5 g（10%）+ 甲酰胺 5 mL（10%）+ 20× SSC 5 mL（2×）+ 水定容 |
| 洗涤缓冲液（50 mL） | 20× SSC 5 mL（2×）+ 甲酰胺 5 mL（10%）+ 水定容 |
| 2× SSC 漂洗液（50 mL） | 20× SSC 5 mL + 水定容至 50 mL |
分步方案
Part 1｜细胞接种与配体剂量-响应处理（8–9 天）
- 每个 18 mm 盖玻片（12 孔板）接种 100,000 个 MCF7 细胞，固定当天达 70–80% 汇合；规划样本（如 4 剂量 × 3 重复 = 12 样本）；
- 每孔 1 mL 完全培养基，枪头轻压盖玻片排气泡；接种后十字方向轻晃混匀。CRITICAL不要画圈晃——会形成边缘环状或中心集中生长；
- 37°C 恢复 2–3 天；去激素培养基洗 3 次（每次 37°C 孵 1 h），再去激素培养 3 天至稳态；
- 换含配体培养基（1 mL/孔），处理 3 天至稳态转录活性。
Part 2｜固定与通透（1 h + 过夜）
- PBS 手动摇洗 3 次（20–25°C，无需摇床）；CRITICAL固定液与洗涤液全部收集进带标签危废容器，严禁倒入水槽；
- 1 mL 4% PFA 固定；PBS 洗 2 次 × 10 min；
- 2 mL 70% 乙醇，4°C 通透 12–16 h，封口膜密封防蒸发；NOTE替代方案：甲醛固定 + Triton X-100 短时通透，需滴定浓度与时间。
Part 3｜smFISH 探针杂交（6–7 h）
- 回温缓冲液与探针；按每片 50 μL 配工作液：12.5 μM 外显子探针 0.4 μL + 12.5 μM 内含子探针 0.4 μL + 杂交缓冲液 49.2 μL；
- 预杂交：吸去 70% 乙醇（入易燃废液容器），1 mL 洗涤缓冲液洗 2–5 min；
- 10 cm 皿底画线分 6 区编号（两皿 12 片），铺封口膜，每区滴 50 μL 探针液；盖玻片细胞面朝下盖上；
- 每皿放浸了 1 mL 水的湿纸巾保湿，封口膜密封，避光孵育：37°C 4 h 或 30°C 12–16 h，不要摇晃。
Part 4｜杂交后洗涤与封片（1.5 h + 干燥过夜）
- 杂交至 3.5 h 时预温洗涤缓冲液 30 min；37°C 洗 2 × 30 min；
- 2× SSC 漂洗；1× PBS 孵 5 min（避光）；
- 盖玻片边缘靠干 20–30 s，滴 ProLong Gold + DAPI 封片，细胞面朝下，避光室温干燥 12–16 h。
Part 5｜smFISH 采集与分析（每片约 20 min）
- 每样本 5×5 tile、40× 物镜，覆盖 ≥1000–2000 个细胞；Z-stack 10 μm / 0.5 μm 步长（21 层）；
- smFISH 通道（Quasar 570/670）100% LED、500 ms；DAPI 25% LED、25 ms；
- 分析：CellProfiler + 自定义 Python 管线（最大强度投影 → 带通滤波 → 局部背景扣除 → 2D 高斯拟合检测斑点、共定位与每位点 RNA 定量）；
- 跨条件比较转录细胞比例（%TS）与爆发大小（取活性平台期剂量）。
Part 6｜活细胞成像的接种与处理（8–9 天）
- 100,000 个 TFF1-MS2 报告细胞接种 NUNC Lab-Tek 双腔室玻底皿，成像当天汇合度 50–70%；
- 恢复 2–3 天；去激素培养基洗 3 次再去激素培养 3 天；
- 换最大浓度含药培养基（如 1 nM E2 或 10 μM EDC），处理 8 h 后上镜；NOTETFF1 转录因子结合在诱导后 8 h 达稳态——此时成像捕捉的是稳态而非瞬时爆发动力学。
Part 7｜活细胞 MS2 采集（每次约 14.2 h）
- 先以 6% 激光功率拍短测试片查光漂白，信号不稳就降功率重测；
- 开自动对焦防焦漂；参数：7 个 Z 平面 / 0.8 μm 间隔，100 s/轮，512 帧（≈14.2 h），曝光 40 ms/帧；
- 每条件 7–10 个视野，保证 ≥30–50 个正在转录的细胞。
Part 8｜细胞追踪与裁剪（FIJI + TrackMate）
- 生成每视野最大强度投影时间序列；TrackMate 中选 LoG 检测器（输入核直径，Preview 验证）+ LAP 追踪器（连接/断线距离均 15 μm，frame gap = 0）；
- 播放动画目检轨迹，必要时调参重跑；导出轨迹 CSV；
- 用 TrackMateTiffCrop.py 按核中心坐标 ± 窗口尺寸裁出单细胞时间序列。
Part 9｜MS2 斑点分割与 HMM 拟合（Localize + Python）
- CRITICAL先把首个爆发的首帧复制到影片开头（否则 Localize 捕捉不到首个静默期），追踪完成后删除该重复帧；
- Localize：Auto bpass = ON、FCS mode = ON；Segment with ROI 画 ROI 包住同一等位基因两个连续爆发，目检 .loc 定位正确，否则扩大 ROI 重来；逐对爆发分割后合并 .loc、去重叠帧；
- Track → Track 生成 .trk 轨迹；trkCheck.ijm 宏目检轨迹叠加；
- 运行 traceHMMFit.py：HMM 拟合 ON/OFF 状态，输出中位/平均时长（分钟）与 TrkONOFFSummary.txt；画 ON/OFF 时长累积分布图。
Part 10｜smFISH 与 MS2 数据整合
- 比较归一化 TS 强度 → 判断爆发大小变化；
- 比较 %TS → 提示活性等位基因比例或爆发起始变化；
- 比较 MS2 的爆发起始速率 → 区分上述两种机制；比较 MS2 驻留时间 → 判断爆发时长变化。
预期结果
- smFISH：明亮点状 RNA 斑点，线扫呈单峰高于背景；内含子斑点核内为主，外显子斑点核质均有；每条件 ≥约 1000 细胞；饱和 E2 下 TFF1 约 ~70 RNA 分子/细胞（因细胞系而异），中位爆发大小约 1.5–3 RNA/转录位点；
- MS2 活细胞：核内 GFP 表达分布宽，20–30% 细胞无可见信号（不显示转录位点）；表达过高者核背景淹没斑点——取中等表达细胞分析；
- 整合解读示例：E2 剂量响应可能主要提高爆发频率（TS 细胞比例与每位点爆发次数同增），而 TRIM24 抑制主要缩小爆发大小而对活性细胞比例影响很小。
Troubleshooting 速查
| 问题 | 解决 |
|---|---|
| MS2 位点不可见 / 核背景过高 | MCP-GFP 表达过高：流式分选中等荧光亚群（排除过亮与过暗细胞），保留 1–3 个明亮位点可辨 |
| MS2 无位点 / 核标记弱 | MCP 表达过低：调表达框（启动子/筛选策略）重新流式富集，先短测试片验证再长时程 |
| smFISH 信号弱或无 | 优化杂交温度（推荐值附近窄范围）与甲酰胺浓度，新探针做小矩阵条件测试 |
| 探针渗透差 / 信号不均 | 改甲醛固定 + Triton X-100 短时通透，滴定浓度与时间 |
| 远红通道无信号 | 确认 Cy5/Alexa 647 激发与滤光片组，用阳性对照或荧光微球验证 |
局限性
- 只定量单一内源位点（TFF1）；推广到其他基因需逐一构建 MS2 敲入细胞系，技术难、周期长（3–6 个月/系）；
- MS2 成像依赖 MCP-GFP 表达窗口——过高淹没斑点、过低无信号，需要流式筛选；
- smFISH 是终点法，时间参数必须靠活细胞成像补齐，两法缺一不可；
- 多软件衔接（CellProfiler / TrackMate / Localize / HMM 拟合）对使用者计算背景有一定要求。