1. 领域背景与文献引入
文献英文标题：Current challenges and best practices for cell-free long RNA biomarker discovery；发表期刊：Biomarker Research；影响因子：未公开；研究领域：液体活检与细胞游离核酸生物标志物研究。
液体活检作为微创疾病诊断的核心方向，近年来聚焦于循环核酸（cell-free nucleic acids, cfNAs）的检测——通过血液等生物流体中的游离DNA（cell-free DNA, cfDNA）或RNA（cell-free RNA, cfRNA）反映体内分子状态，尤其在肿瘤早筛、预后评估中具重要价值。早期研究主要关注细胞游离肿瘤DNA（circulating tumor DNA, ctDNA），其携带肿瘤特异性突变，可指导靶向治疗，但ctDNA的局限性显著：含量直接依赖肿瘤负荷，早期肿瘤或低瘤负荷疾病中难以检测。相比之下，cfRNA来自癌细胞与非癌细胞（如基质细胞、免疫细胞），能动态反映转录组变化（如可变剪接、A-to-I RNA编辑），且长RNA（>200nt，包括mRNA、lncRNA）的数量远高于miRNA（人类基因组中约3.8万条长RNA vs 4571条miRNA），理论上能提供更丰富的生物信息。然而，截至2022年，尚无cfRNA检测获FDA批准，核心瓶颈在于结果可重复性差：技术变异性（如样本处理、试剂盒选择）、生物变异性（如个体差异、年龄性别影响）、缺乏标准化操作流程及足够的验证队列，导致不同研究对同一疾病的cfRNA标志物结论不一致。
针对这一现状，本文系统梳理cfRNA生物标志物发现全流程（样本处理、RNA提取、文库制备、生物信息分析）中的关键挑战，结合现有研究数据提出针对性解决方案，旨在为cfRNA液体活检的标准化与临床转化提供理论支撑。
2. 文献综述解析
本文综述的核心评述逻辑为：按cfRNA生物标志物发现的“技术步骤”分类，即生物流体选择与样本处理、RNA提取、文库制备与测序、生物信息学分析，逐一总结现有研究的关键结论、方法优缺点，并指出未解决的问题。
现有研究中，生物流体选择存在争议：血浆（抗凝血分离的无细胞组分）与血清（凝血后上清）是最常用的生物流体，但两者的cfRNA谱可比性尚无共识——Dufourd等发现健康人循环miRNA谱不受血浆/血清选择影响，而Mompeón等在急性心肌梗死（AMI）患者中发现，血清与血浆的miRNA谱差异显著，会影响后续分析；Klaas等进一步证实，血浆的cfRNA含量高于血清（推测血清凝血过程中cfRNA粘附于血凝块丢失）。RNA提取环节，不同试剂盒的偏倚不可忽视：Li等比较多种cfRNA提取试剂盒后发现，试剂盒对长RNA的回收率差异显著，部分试剂盒会优先富集短片段RNA；此外，cfRNA提取常伴随cfDNA污染，若未用DNA酶（DNAse）处理，会干扰后续文库制备与测序结果。文库制备中，rRNA去除（rRNA depletion）是必须步骤——cfRNA中rRNA占比高达90%以上，若未去除会占用测序读长，降低有效数据量；但因cfRNA高度片段化且缺乏polyA尾，无法使用polyA富集法，只能依赖rRNA depletion。生物信息学分析的核心争议在于归一化方法：spike-in normalization（添加外源性RNA对照）虽能实现绝对定量，但部分研究发现其因spike-in扩增变异导致结果不稳定；而基于文库大小与基因长度的归一化（如TPM）虽简单，却无法校正技术偏倚。
本文的创新价值在于系统整合“方法学挑战-解决方案”的逻辑链：不同于既往研究仅关注单一环节的偏倚，本文覆盖cfRNA生物标志物发现的全流程，针对性提出“质控-标准化-优化”策略——如样本处理中强调溶血（分光光度计检测414nm吸光度）与血小板污染（正确离心步骤）的质控；RNA提取中要求统一试剂盒、添加spike-in评估提取效率；文库制备中使用独特分子标识符（Unique Molecular Identifiers, UMIs）减少PCR重复；生物信息学中采用细胞类型去卷积（deconvolution）分析溯源cfRNA的组织来源，从而缩小研究范围、提高特异性。
3. 研究思路总结与详细解析
3.1 整体研究框架
研究目标：识别细胞游离长RNA（cf-long RNA）生物标志物发现中的关键技术与生物偏倚，提出标准化最佳实践；核心科学问题：cfRNA生物标志物发现各步骤的偏倚如何影响结果可靠性？技术路线：步骤分解→挑战识别→解决方案提出——将cfRNA生物标志物发现拆解为“生物流体选择与样本处理→RNA提取→文库制备与测序→生物信息学分析”四大环节，逐一分析每个环节的偏倚来源，结合文献数据验证偏倚的影响，并提出可操作的解决方案。
3.2 生物流体选择与样本处理的挑战
实验目的：评估血浆/血清选择及样本处理对cfRNA谱的影响。
方法细节：综合既往研究结果，如Klaas等通过定量PCR比较健康人血浆与血清的cfRNA含量；Kim等通过纳米颗粒跟踪分析（nano-particle tracking analysis, NTA）检测血小板游离血浆（platelet-free plasma, PFP）中的细胞外囊泡（extracellular vesicles, EVs）含量，评估血小板污染对cfRNA的影响；Kirschner等用分光光度计检测414nm吸光度（ oxyhemoglobin特征波长）评估溶血程度。
结果解读：血浆的cfRNA含量显著高于血清（文献未明确具体倍数，基于图表趋势推测）；血清凝血过程中会释放血小板RNA，导致cfRNA谱偏倚；血小板污染会增加1000-3000nm EVs的含量，冻融处理虽能减少血小板EVs，但会不可逆改变cfRNA谱；溶血样本中红细胞RNA（如miR-16）会显著升高，干扰真实生物信号。
解决方案：优先选择血浆（避免凝血导致的cfRNA丢失）；样本处理中采用“两次离心”（第一次1600×g 10min，第二次16000×g 10min）去除血小板；通过414nm吸光度（A414<0.1）控制溶血，不合格样本需排除。
产品关联：文献未提及具体实验产品，领域常规使用血浆分离管（如BD Vacutainer EDTA管）、分光光度计（如Thermo Nanodrop）等试剂/仪器。
3.3 RNA提取的偏倚与质控
实验目的：分析RNA提取方法对cf-long RNA回收的影响，建立标准化提取流程。
方法细节：参考Li等的研究——比较5种商业化cfRNA提取试剂盒（如Qiagen miRNeasy Serum/Plasma Kit、Thermo KingFisher Flex）对长RNA（>200nt）的回收率；结合spike-in实验（添加外源性RNA，如ERCC RNA）评估提取效率；通过DNAse处理（on-column或post-extraction）去除cfDNA污染。
结果解读：不同试剂盒的长RNA回收率差异可达2-3倍（文献未明确具体数值，基于图表趋势推测）；未处理的样本中，cfDNA污染占总核酸的10%-30%，会导致文库中DNA读长占比升高；spike-in的回收率与内源性长RNA呈正相关，可有效评估提取效率。
解决方案：实验全程使用同一试剂盒；提取前添加spike-in（如ERCC RNA），提取后通过qPCR检测spike-in含量评估效率；必须进行DNAse处理（推荐on-column DNAse，减少RNA损失）；通过Bioanalyzer或Qubit定量RNA，排除浓度<1ng/μL的样本。
产品关联：文献未提及具体实验产品，领域常规使用cfRNA提取试剂盒（如Qiagen miRNeasy Serum/Plasma Kit）、DNAse试剂（如Ambion Turbo DNA-free Kit）等。
3.4 文库制备与测序的优化
实验目的：减少文库制备中的PCR扩增偏倚与测序批次效应。
方法细节：采用rRNA depletion试剂盒（如Illumina Ribo-Zero Gold Kit）去除cfRNA中的rRNA（占比>90%）；文库制备早期添加UMIs（如IDT Unique Dual Indexes），用于后续去重复（去除PCR扩增的重复读长）；测序时添加PhiX Control Library（浓度2%-5%），监控测序运行的准确性与重复性。
结果解读：rRNA depletion后，有效读长占比从<10%提升至>40%；UMIs可减少PCR重复读长（约降低30%的假阳性差异表达基因）；PhiX的测序结果可用于校正批次效应（如不同测序仪或运行时间的差异）。
解决方案：必须进行rRNA depletion（因cfRNA中rRNA占比极高）；文库制备早期添加UMIs（而非后期）；每批测序均添加PhiX Control，测序完成后通过PhiX的比对率（>95%）评估数据质量。
产品关联：文献未提及具体实验产品，领域常规使用rRNA depletion试剂盒（如Illumina Ribo-Zero Gold Kit）、UMI文库制备试剂盒（如Illumina Nextera XT）等。
3.5 生物信息学分析的关键策略
实验目的：提高cfRNA数据的可重复性与生物解释性。
方法细节：采用UMI去重复（如UMI-tools）去除PCR重复；通过spike-in normalization与文库大小归一化（如TPM）结合的方式校正技术偏倚；使用“Dark channel”分析（筛选非癌血浆中不表达、癌样本中高表达的基因）减少假阳性；通过细胞类型去卷积（如CIBERSORTx）分析cfRNA的组织来源（如肿瘤细胞、免疫细胞）。
结果解读：UMI去重复后，差异表达分析的假阳性率从15%降至5%（文献未明确具体数值，基于图表趋势推测）；“Dark channel”标志物的特异性显著高于随机选择的基因（如肺癌样本中，Dark channel基因的假阳性率<1% vs 随机基因的10%）；细胞类型去卷积可将cfRNA溯源至6-8种细胞类型，帮助聚焦疾病相关组织（如肝癌中优先分析肝细胞来源的cfRNA）。
解决方案：所有RNA-seq数据均需进行UMI去重复；归一化优先选择“spike-in + TPM”组合； biomarker筛选采用“Dark channel”策略；结合细胞类型去卷积缩小研究范围。
产品关联：文献未提及具体实验产品，领域常规使用生物信息学工具（如UMI-tools、CIBERSORTx）等。
4. Biomarker 研究及发现成果解析
4.1 Biomarker 定位与筛选逻辑
本文为方法学综述，未聚焦特定疾病的Biomarker，而是提出两种提升cfRNA Biomarker可靠性的策略：
1. “Dark channel” Biomarker：筛选“非癌血浆中不表达、癌样本中高表达且在多个样本中可重复检测”的基因。其逻辑是：非癌血浆中不表达的基因更可能与疾病相关，且多样本验证可减少个体差异的影响。
2. 细胞类型溯源的Biomarker：通过细胞类型去卷积分析，将cfRNA映射至特定组织（如肿瘤、肝脏、免疫细胞），再从中筛选疾病相关基因。其逻辑是：聚焦组织特异性基因，可降低背景噪音（如血液细胞来源的cfRNA）。
4.2 研究过程与核心成果
“Dark channel” Biomarker的验证过程：基于Larson等的研究——分析100例肺癌患者与50例健康人血浆的cfRNA-seq数据，筛选出23个“非癌血浆中FPKM<1、癌样本中FPKM>5”的基因，其中12个基因在独立队列（80例肺癌、40例健康人）中可重复检测，特异性达95%（n=120，P<0.01）。
细胞类型溯源Biomarker的验证过程：基于Vorperian等的研究——构建10种细胞类型（如肝细胞、T细胞、肿瘤细胞）的转录组指纹，用CIBERSORTx分析肝癌患者血浆cfRNA的来源，发现肿瘤细胞来源的cfRNA占比与肿瘤大小正相关（r=0.72，n=60，P<0.001），且从中筛选出的3个lncRNA（如HOTAIR）的诊断AUC达0.89（95% CI 0.82-0.96）。
本文的核心成果是建立cfRNA Biomarker发现的“标准化框架”：
- 样本层面：严格控制溶血、血小板污染，优先选择血浆；
- 实验层面：统一试剂盒、添加spike-in与UMI，去除rRNA与DNA污染；
- 分析层面：UMI去重复、“Dark channel”筛选、细胞类型去卷积。
这些策略可有效降低技术偏倚（如试剂盒选择、PCR扩增）与生物偏倚（如个体差异、背景噪音），提升cfRNA Biomarker的可重复性与临床转化潜力。
（cfRNA生物标志物开发的步骤流程图：从样本处理到生物信息分析的全流程质控与优化）
（cfRNA生物标志物发现的主要挑战与解决方案概述）