1. 领域背景与文献引入
文献英文标题：NONO links circadian rhythm disruption and enhanced tumor-fibroblast crosstalk in right-sided colorectal cancer；发表期刊：Biomarker Research；影响因子：未公开；研究领域：结直肠癌侧性异质性与昼夜节律调控
结直肠癌是全球发病率第三、死亡率第二的恶性肿瘤，按解剖位置可分为左侧（降结肠、乙状结肠）和右侧（盲肠、升结肠）。两者在临床表型、分子特征及预后上存在显著异质性：右侧肿瘤多表现为贫血、腹部不适，常伴微卫星不稳定性（MSI）和BRAF突变；左侧肿瘤多表现为便血、肠梗阻，更易发生染色体不稳定性（CIN）和KRAS、TP53突变。这种侧性异质性给临床治疗（如免疫治疗响应差异）带来巨大挑战，但潜在调控机制尚未完全阐明。
昼夜节律紊乱作为癌症的新兴特征，通过破坏核心钟基因（如CLOCK、BMAL1）的反馈环路，影响细胞增殖、凋亡、DNA修复及免疫 surveillance，已被证实与乳腺癌、肝癌等肿瘤进展相关。然而，昼夜节律紊乱对结直肠癌侧性异质性的贡献仍不清楚，尤其是其如何调控肿瘤微环境（TME）的形成缺乏研究。
针对这一空白，本研究整合单细胞转录组与空间转录组分析，解析右侧结直肠癌中昼夜节律紊乱的分子特征，重点探究NONO阳性肿瘤细胞（NONO⁺ TC）在连接昼夜节律紊乱与促肿瘤微环境中的作用，为结直肠癌侧性特异性治疗提供新靶点。
2. 文献综述解析
作者围绕“结直肠癌侧性异质性的临床与分子差异”“昼夜节律紊乱与癌症的关联”“NONO的生物学功能”三大维度展开综述，系统梳理现有研究的进展与局限：
现有研究关键结论
- 结直肠癌侧性异质性：右侧肿瘤具有更高的MSI和BRAF突变率，左侧更多CIN和KRAS、TP53突变；右侧肿瘤微环境炎症反应更显著，免疫逃逸机制更活跃。
- 昼夜节律紊乱与癌症：核心钟基因（如PER2、CRY1）的突变或表达异常，可通过影响细胞周期（如Cyclin D1节律）、免疫细胞功能（如T细胞增殖）促进肿瘤进展；昼夜节律紊乱（如轮班工作）会增加结直肠癌风险。
- NONO的功能：NONO作为RNA结合蛋白，参与RNA可变剪接（如调控PTEN前mRNA剪接导致PI3K/AKT通路激活）、缺氧信号（稳定HIF-1α mRNA增强缺氧应答），在乳腺癌、胶质瘤中促进肿瘤增殖和侵袭。
现有研究局限性
- 缺乏昼夜节律紊乱与结直肠癌侧性异质性的直接关联研究；
- NONO在结直肠癌TME中的作用及与 stromal 细胞的通讯机制未阐明；
- 未揭示NONO与昼夜节律紊乱在结直肠癌中的功能联系。
本研究创新点
- 首次整合单细胞与空间转录组，发现右侧结直肠癌肿瘤细胞具有更高的昼夜节律紊乱（CRD）评分，且NONO⁺ TC是其核心分子特征；
- 揭示NONO⁺ TC与成纤维细胞的空间共定位及特异性通讯（TENASCIN、THBS通路），证明NONO增强肿瘤细胞对成纤维细胞信号的接收能力；
- 通过功能实验验证NONO通过调控核心钟基因（如PER2）和TME受体（如ITGB1、SDC1）促进肿瘤增殖，建立NONO连接昼夜节律紊乱与促肿瘤微环境的机制框架。
3. 研究思路总结与详细解析
整体框架概括
研究目标：解析昼夜节律紊乱对右侧结直肠癌侧性异质性的调控机制，明确NONO⁺ TC的功能及与成纤维细胞的通讯机制。
核心科学问题：NONO如何连接昼夜节律紊乱与右侧结直肠癌的促肿瘤成纤维细胞 crosstalk？
技术路线：单细胞转录组分析CRD特征→空间转录组验证细胞共定位→CellChat解析通讯通路→功能实验验证分子机制（闭环逻辑）。
3.1 结直肠癌单细胞转录组图谱构建与细胞亚群注释
实验目的：构建左右侧结直肠癌的单细胞转录组图谱，解析细胞亚群组成差异。
方法细节：收集8例左侧、8例右侧结直肠癌患者的新鲜组织样本，进行单细胞RNA测序（scRNA-seq）；用Seurat包进行质控（过滤基因数200-4000、线粒体基因比例<10%的细胞）、归一化及聚类，基于marker基因（肿瘤细胞：KRT8/KRT18；成纤维细胞：COL1A1/COL3A1；Treg：IL7R/FYB1）注释11种细胞亚群。
结果解读：右侧肿瘤细胞（p<0.01）和浆细胞（p<0.05）比例显著高于左侧，左侧Treg（p<0.05）和单核细胞（p<0.05）比例更高；肿瘤细胞亚群在左右侧分布差异明显，右侧肿瘤细胞亚群12、14、16、17更集中（图1）。
产品关联：实验所用抗体来自Abmart Pharmaceuticals，包括NONO抗体（货号T58525S）、EpCAM抗体（货号TN24218S）、Vimentin抗体（货号T55134S）。
3.2 昼夜节律紊乱评分与NONO⁺肿瘤细胞鉴定
实验目的：评估左右侧肿瘤细胞的CRD程度，筛选核心调控分子。
方法细节：用AUCell、UCell、singscore、ssGSEA、AddModuleScore五种方法计算细胞CRD评分；通过火山图筛选右侧肿瘤细胞高表达基因；用Pearson/Spearman相关分析NONO表达与CRD评分的相关性。
结果解读：右侧肿瘤细胞的CRD评分显著高于左侧（p<0.0001）；NONO是右侧肿瘤细胞高表达的核心基因（avg_log2FC>1，p<0.001），且其表达与CRD评分呈显著正相关（Pearson r=0.262，Spearman ρ=0.348，均p<0.001）；NONO⁺ TC的CRD评分显著高于NONO⁻ TC（p<0.001）（图2）。
3.3 空间转录组解析NONO⁺ TC与成纤维细胞的空间共定位
实验目的：验证NONO⁺ TC与成纤维细胞的空间分布关系。
方法细节：收集4例右侧结直肠癌患者的空间转录组样本，用RCTD进行细胞类型反卷积；结合HE染色和空间聚类结果，分析NONO⁺ TC与成纤维细胞的空间分布；用mistyR进行多尺度空间相互作用分析。
结果解读：NONO⁺ TC主要分布在肿瘤巢，而成纤维细胞富集在NONO⁺ TC簇的边界，形成直接细胞界面；空间相互作用分析显示，成纤维细胞对NONO⁺ TC的重要性评分在intra（55.21）、juxta（40.04）层均显著高于其他细胞类型（均p<0.001）（图3、图5）。
3.4 细胞通讯分析揭示NONO⁺ TC与成纤维细胞的信号通路
实验目的：解析NONO⁺ TC与成纤维细胞的通讯机制。
方法细节：用CellChat分析单细胞数据中的细胞通讯，聚焦NONO⁺ TC与成纤维细胞的相互作用；筛选关键信号通路（如TENASCIN、THBS、COLLAGEN），用DotPlot展示配体-受体对的表达。
结果解读：成纤维细胞是TENASCIN、THBS信号的主要发送者，NONO⁺ TC是主要接收者；TENASCIN通路仅存在于NONO⁺ TC与成纤维细胞之间，是其特异性通讯通路；关键配体-受体对（如THBS1-ITGB1、COL1A1-SDC1）在两者中高表达，介导信号传递（图6）。
3.5 功能实验验证NONO的促肿瘤作用及机制
实验目的：验证NONO对肿瘤细胞增殖、迁移的影响及分子机制。
方法细节：用siRNA沉默RKO、HCT116细胞的NONO；用CCK-8（24h检测OD450）、伤口愈合（0h/24h拍照计算 closure rate）、EdU（50μM EdU孵育2h，荧光计数阳性细胞比例）实验检测增殖和迁移；用qRT-PCR检测核心钟基因（PER2）和微环境受体（ITGB1、SDC1）的表达。
结果解读：NONO沉默显著抑制肿瘤细胞增殖（CCK-8 OD450降低约30%，n=3，p<0.01）和迁移（伤口 closure rate 降低约40%，n=3，p<0.01）；EdU阳性率降低约25%（n=3，p<0.01）；PER2、ITGB1、SDC1的mRNA表达显著下调（均p<0.05）（图8）。
产品关联：实验所用siRNA来自Tsingke Biotechnology Co., Ltd.，CCK-8试剂盒来自Beyotime（货号C0038），EdU试剂盒来自Beyotime（货号C0071S）。
4. Biomarker 研究及发现成果解析
Biomarker定位
本研究的Biomarker是NONO阳性肿瘤细胞（NONO⁺ TC），属于细胞亚群标志物。其筛选/验证逻辑为：“单细胞转录组筛选右侧肿瘤细胞高表达基因→空间转录组验证空间分布→功能实验验证生物学功能→临床数据库验证预后价值”。
研究过程详述
Biomarker来源：临床右侧结直肠癌组织样本的肿瘤细胞。
验证方法：
1. 单细胞转录组：NONO⁺ TC在右侧肿瘤中富集，且CRD评分更高；
2. 空间转录组：NONO⁺ TC与成纤维细胞空间共定位；
3. 免疫荧光：多重免疫荧光染色（NONO/EpCAM/Vimentin）验证NONO⁺ TC在肿瘤巢中的分布（图7）；
4. 临床数据库：TCGA分析显示，NONO高表达与结直肠癌患者较差预后相关（p<0.05）。
特异性与敏感性：NONO⁺ TC在右侧结直肠癌中的比例显著高于左侧（p<0.001）；其CRD评分与NONO表达呈显著正相关（Pearson r=0.262，p<0.001）。
核心成果提炼
- 特征性：NONO⁺ TC是右侧结直肠癌的特征性细胞亚群，其CRD评分显著高于左侧及NONO⁻ TC；
- 功能关联：NONO⁺ TC通过增强对成纤维细胞信号（TENASCIN、THBS通路）的接收能力，促进肿瘤增殖和迁移；
- 预后价值：NONO高表达是结直肠癌患者的不良预后标志物（HR=1.5，95% CI 1.1-2.0，p<0.05）；
- 机制创新：首次揭示NONO作为昼夜节律调控因子，通过调控核心钟基因（PER2）和微环境受体（ITGB1、SDC1），连接昼夜节律紊乱与右侧结直肠癌的促肿瘤微环境形成（图9）。
本研究为结直肠癌侧性异质性的调控机制提供了新视角，NONO⁺ TC有望成为右侧结直肠癌的特异性治疗靶点，为临床侧性分层治疗提供理论依据。