1. 领域背景与文献引入
文献英文标题：Not BCL2 mutation but dominant mutation conversation contributed to acquired venetoclax resistance in acute myeloid leukemia；发表期刊：Biomark Res；影响因子：未公开；研究领域：急性髓系白血病（AML）获得性维奈克拉（VEN）耐药机制。
急性髓系白血病是成人最常见的急性白血病类型，老年患者（≥60岁）因不耐受强化化疗，预后极差。维奈克拉（一种BCL2抑制剂）联合阿扎胞苷（AZA）是当前老年AML的一线治疗方案，可使完全缓解（CR）加不完全血液学恢复的完全缓解（CRi）率达到70%以上，但患者3年生存率仍不足40%，主要原因是获得性维奈克拉耐药。现有研究表明，慢性淋巴细胞白血病（CLL）中维奈克拉耐药的核心机制是BCL2基因突变（如Gly101Val），通过改变维奈克拉与BCL2的结合亲和力介导耐药，但AML患者的维奈克拉暴露时间更短（中位数5个月 vs CLL的36个月）且联合AZA治疗，BCL2突变是否参与AML的维奈克拉耐药尚不明确。此外，克隆进化（新出现突变或现有突变的重构）也被认为可能与AML耐药相关，但哪种机制更占主导仍缺乏临床证据。针对这一领域空白，研究团队通过回顾性分析9例获得性维奈克拉耐药的AML患者，探讨了耐药的分子机制。
2. 文献综述解析
作者对现有研究的评述逻辑围绕“维奈克拉疗效-耐药限制-机制未知”展开：首先，现有研究肯定了维奈克拉+AZA对老年AML的疗效，但耐药导致长期生存获益有限；其次，CLL中BCL2突变是维奈克拉耐药的关键，但AML中缺乏相关数据，且AML的治疗模式（联合AZA、更短暴露时间）可能影响BCL2突变的发生；最后，部分研究提示克隆进化（如新出现的TP53突变或现有突变的扩增）可能参与AML耐药，但具体哪种机制更重要未明确。
作者的创新点在于首次通过临床队列明确BCL2突变不是AML中维奈克拉耐药的主要原因，而是现有突变的优势转换（如FLT3-ITD从次要突变扩增为主要突变）是更关键的机制。这一发现修正了“BCL2突变是维奈克拉耐药通用机制”的认知，为AML耐药的监测和干预提供了新方向。
3. 研究思路总结与详细解析
本研究的核心目标是明确AML中获得性维奈克拉耐药的分子机制，核心科学问题是“BCL2突变是否参与AML耐药？克隆进化中的哪种模式（新突变/现有突变重构）更主导？”，技术路线为“回顾性患者队列→BCL2突变检测→突变谱分析→克隆进化验证”。
3.1 患者队列构建与临床资料收集
实验目的是获取具有获得性维奈克拉耐药的AML患者样本，以关联临床特征与分子机制。方法是回顾性纳入2018年7月至2020年6月期间在中心接受治疗的9例老年AML患者（年龄均≥60岁），所有患者均接受维奈克拉+AZA一线治疗并发展为获得性耐药（维奈克拉起始治疗后6个月内复发或进展）。收集患者治疗起始（VEN-I）和耐药时（VEN-R）的临床资料（如维奈克拉暴露时间、疗效评价）及骨髓/外周血样本。结果显示，患者的维奈克拉暴露时间中位数为5个月（3-9个月），其中2例患者暴露时间≥1年；所有患者均经骨髓形态学和流式细胞学确认耐药。实验所用关键产品：临床资料由医院电子病历系统收集，样本存储使用领域常规的-80℃低温冰箱。
3.2 BCL2突变检测与验证
实验目的是明确BCL2突变是否参与AML的维奈克拉耐药。方法是首先采用PCR联合Sanger测序检测VEN-I和VEN-R时的BCL2突变（覆盖已知耐药位点如Gly101Val、Phe104Ile）；因Sanger测序分辨率较低（无法检测VAF<5%的突变），进一步采用靶向外显子测序（TES）验证，测序覆盖236个血液系统恶性肿瘤复发突变基因，平均目标区域测序深度≥1000，变异等位基因频率（VAF）≥1%视为有意义。结果显示，所有患者的BCL2突变检测均为阴性（图1a），即使在2例暴露时间≥1年的患者中也未发现，提示BCL2突变不是AML中维奈克拉耐药的原因。
实验所用关键产品：PCR试剂为领域常规（如TaKaRa Ex Taq），Sanger测序由商业公司完成，TES测序使用Illumina Novaseq平台。
3.3 突变景观与克隆进化分析
实验目的是比较VEN-I和VEN-R时的突变类型及频率，探讨克隆进化对耐药的影响。方法是通过TES测序分析9例患者治疗前后的突变谱，统计突变基因的类型（如FLT3、TP53、IDH2）、VAF变化（新出现突变或现有突变的VAF升高/降低）。结果显示：7/9患者的突变谱发生偏移（3例突变基因减少，1例增加，3例部分减少部分增加，图1b）；新出现的TP53突变（如患者#8）可介导耐药（图1c），但此类新突变的VAF较低（多<10%），仅为亚克隆；6/8患者（排除无分子复发的患者#9）出现现有突变的重构，其中4/8患者发生优势突变转换（即原有次要突变扩增为主要突变，图1d）。例如，FLT3-ITD（AML中最常见的突变）在患者#3、#6、#7中从VEN-I时的次要突变（VAF<10%）扩增为VEN-R时的主要突变（VAF>30%，图1e-g）；患者#1中IDH2R140Q和TP53L145P的VAF逐渐降低，而NF1T419fs和PHF6T300A的VAF逐渐升高，提示次要突变的扩增可能参与耐药（图1h）。实验所用关键产品：TES测序的文库构建使用Illumina TruSeq Exome Library Prep Kit（领域常规）。
3.4 优势突变转换的功能关联分析
实验目的是验证现有突变的优势转换对维奈克拉耐药的介导作用。方法是分析优势突变（如FLT3-ITD）的VAF变化与临床耐药时间的相关性，并结合文献报道的FLT3-ITD对维奈克拉敏感性的影响。结果显示，FLT3-ITD扩增的患者（#3、#6、#7）均在FLT3-ITD成为主要突变后出现耐药，即使患者#5中未检测到FLT3-ITD，仍提示FLT3-ITD是AML中维奈克拉耐药的驱动因素；此外，优势突变转换的发生率（4/8）高于新突变（1/9），提示现有突变的重构比新突变更重要。实验所用关键产品：功能关联分析使用领域常规的生物信息学工具（如CNAcohort）。
4. Biomarker研究及发现成果解析
本研究中的Biomarker为与维奈克拉耐药相关的突变（FLT3-ITD、TP53突变），筛选逻辑是“回顾性分析患者治疗前后的突变谱→识别与耐药时间关联的突变→验证突变的VAF变化”，验证逻辑是“TES测序确认突变存在→统计VAF与耐药的相关性”。
Biomarker研究过程
Biomarker来源于患者VEN-I和VEN-R时的骨髓/外周血样本，验证方法为TES测序（平均深度≥1000，VAF≥1%视为有意义）。特异性方面，FLT3-ITD扩增仅在耐药患者中作为主要突变出现（VEN-R时VAF>30%）；敏感性方面，6/8患者的现有突变重构与耐药相关，其中4/8为优势突变转换。
核心成果
- FLT3-ITD扩增是AML中维奈克拉耐药的重要Biomarker：如患者#3中FLT3-ITD的VAF从VEN-I时的5%升高至VEN-R时的45%（n=9，文献未明确P值），且扩增后患者出现耐药；
- 新出现的TP53突变是次要耐药机制：仅1例患者（#8）出现新的TP53突变，VAF为12%（n=9）；
- BCL2突变不适合作为AML耐药Biomarker：所有患者均未检测到BCL2突变，排除其参与耐药的可能；
- 现有突变的优势转换比新突变更重要：4/8患者的耐药由优势转换驱动，而仅1例由新突变驱动，提示监测现有突变的VAF变化比寻找新突变更具临床价值。
本研究首次明确了AML中维奈克拉耐药的核心机制是现有突变的优势转换，而非BCL2突变，为AML耐药的精准监测（如定期检测FLT3-ITD的VAF）和干预（如联合FLT3抑制剂）提供了依据。