1. 领域背景与文献引入
文献英文标题：Multi-faceted attributes of salivary cell-free DNA as liquid biopsy biomarkers for gastric cancer detection；发表期刊：Biomarker Research；影响因子：未公开；研究领域：胃癌液体活检、唾液游离DNA生物标志物。
液体活检因非侵入性优势成为癌症诊断的重要方向，其中血浆游离DNA（cfDNA）的突变检测已用于多种癌症，但胃癌因肿瘤异质性高、缺乏特异性驱动突变，循环肿瘤DNA（ctDNA）检测敏感性受限。近年研究发现，cfDNA的非突变特征（如片段组学、末端基序、微生物组贡献）可辅助癌症检测，成为替代策略。唾液作为易获取的生物流体，此前已发现其蛋白、RNA成分可作为胃癌生物标志物，但唾液游离DNA（ScfDNA）的结构特征及临床价值尚未系统解析——现有研究仅关注ScfDNA的单一维度（如片段长度），未综合分析其多维度特征（片段组学、末端基序、微生物来源、功能元件）在胃癌中的差异。本研究旨在通过“Broad-Range 游离DNA测序（BRcfDNA-seq）”技术，系统分析ScfDNA的多维度特征，探索其作为胃癌液体活检生物标志物的潜力，填补ScfDNA临床应用的研究空白。
2. 文献综述解析
文献综述围绕“血浆cfDNA的应用局限→非突变特征的研究进展→唾液作为生物流体的优势→ScfDNA的研究空白”展开核心评述：
- 现有研究关键结论：血浆cfDNA的非突变特征（如片段长度分布、末端基序）可区分癌症与健康人群；唾液的蛋白（如CSTB、DMBT1）和RNA（如外泌体RNA）已被验证为胃癌生物标志物；但ScfDNA的结构特征（如多峰片段分布、末端基序多样性）及临床价值未被系统报道。
- 现有研究局限性：缺乏对ScfDNA多维度特征的综合分析，尤其未探索其在胃癌中的差异；传统文库制备方法难以捕获ScfDNA的多种构象（单链、双链、带缺口），限制了特征解析的完整性。
- 本研究创新点：首次采用BRcfDNA-seq技术（单链文库制备）整合ScfDNA的多种构象，系统分析其片段组学、末端基序、微生物组、功能元件等多维度特征；首次验证ScfDNA多维度特征对胃癌的区分能力，为其作为液体活检生物标志物提供依据。
3. 研究思路总结与详细解析
本研究以“探索ScfDNA多维度特征及胃癌区分能力”为目标，核心科学问题是“ScfDNA的多维度特征能否有效区分胃癌与非癌样本”，技术路线为“样本收集→ScfDNA提取→BRcfDNA-seq文库制备→多维度特征解析→统计验证”的闭环设计。
3.1 样本收集与ScfDNA提取
实验目的：获取合格的唾液样本及ScfDNA。
方法细节：纳入10例胃癌患者（经内镜确诊）和10例非癌志愿者（胃镜示胃炎），按标准操作流程（SOP）收集唾液，4℃ 2600×g离心15分钟取上清，再10000×g离心15分钟去除残留细胞；用Qiagen QIAmp循环核酸试剂盒提取1mL唾液中的ScfDNA，不添加载体RNA，最终洗脱体积20μL。
结果解读：电泳显示ScfDNA有两条带——~150bp（单核糖核小体cfDNA）和>1500bp（基因组DNA污染），符合细胞游离DNA的典型特征（补充图1A）。
实验所用关键产品：Qiagen的QIAmp Circulating Nucleic Acid Kit（货号55114）、Qiagen的ATL Lysis buffer（货号19076）。
3.2 ScfDNA构象分析
实验目的：明确ScfDNA的分子构象（单链、双链、带缺口）。
方法细节：用链特异性核酸酶处理健康人ScfDNA——Arcticzyme双链DNA酶（降解双链DNA）、Exonuclease 1（降解单链DNA）、PreCR修复酶（修复带缺口DNA），随后制备单链/双链文库，电泳分析片段分布。
结果解读：经不同酶处理后，ScfDNA电泳显示300bp和200bp条带（对应~160bp单核糖核小体cfDNA和~50bp超短cfDNA，扣除160bp文库接头），表明ScfDNA存在单链、双链、带缺口的多种构象（补充图1B）。
实验所用关键产品：ArcticZyme的dsDNase（货号70600-201）、NEB的Exonuclease 1（货号M0293S）、NEB的PreCR Repair（货号M0309S）。
3.3 BRcfDNA-seq文库制备与测序
实验目的：构建ScfDNA的单链文库，保留多构象信息。
方法细节：用Claret Bioscience的SRSLYTM PicoPlus试剂盒制备单链文库——取18μL ScfDNA进行热休克，采用低分子权重保方案保留小片段，PCR扩增11个循环；用Illumina Novaseq 6000测序仪（2×150bp），每个样本产出约4000万条读段。
结果解读：单链文库有效整合了ScfDNA的多种构象，测序数据覆盖片段组学、末端基序等多维度分析需求，避免了双链文库对单链/超短片段的遗漏。
实验所用关键产品：Claret Bioscience的SRSLYTM PicoPlus DNA NGS Library Preparation Base Kit（货号CBS-K250B-24）、Illumina Novaseq 6000测序仪。
3.4 多维度特征生物信息学分析
实验目的：解析ScfDNA的片段组学、末端基序、微生物组及功能元件特征。
方法细节：用SRSLYumi软件对测序数据去 multiplex，BBmerge合并配对读段，fastp修剪接头；用Bowtie2比对人类基因组（hg38）和Lambda噬菌体基因组，未比对读段用OneCodex比对微生物数据库；用samtools分析片段长度，HOMER识别功能元件（启动子、外显子），Prism8进行t检验和AUROC分析，ClustVis做PCA（主成分分析）和层次聚类。
结果解读：胃癌与非癌样本的ScfDNA在片段长度（峰谷指数）、末端4-mer基序（87个差异基序）、微生物来源比例（胃癌组更高）、功能元件覆盖（非癌组启动子/外显子覆盖更高）上存在显著差异；多维度特征整合后，PCA的PC1轴可有效区分两组（p<0.0001）。
4. Biomarker研究及发现成果解析
4.1 Biomarker定位与筛选逻辑
本研究的生物标志物为ScfDNA的多维度特征组合，包括：（1）片段组学特征（峰谷指数、<100bp与>100bp片段比）；（2）末端基序特征（87个差异4-mer基序）；（3）微生物组特征（微生物来源比例、多样性）；（4）功能元件特征（峰数量、基因组区域覆盖）。筛选逻辑为“描述基础特征→比较组间差异→整合特征验证区分能力”：先通过BRcfDNA-seq解析ScfDNA的构象和片段分布，再比较胃癌与非癌样本的差异特征，最后用多变量分析验证整合特征的区分效能。
4.2 研究过程与核心数据
Biomarker来源：唾液上清的ScfDNA。
验证方法与结果：
- 片段组学特征：胃癌样本的ScfDNA峰谷指数（反映片段分布的“锯齿状”程度）显著低于非癌组（n=10，p=0.0012），AUROC=0.93（区分胃癌与非癌）；<100bp与>100bp片段比在非癌组更高（n=10，p=0.0059），AUROC=0.89。
- 末端基序特征：胃癌样本的末端4-mer基序随机性更低（Shannon熵更低，n=10，p=0.1894），共鉴定出87个差异基序（如G-rich基序在非癌组更丰富）。
- 微生物组特征：胃癌样本的ScfDNA微生物来源比例更高（n=10，p=0.0361），多样性更低（Shannon指数更低，n=10，p=0.1936）。
- 功能元件特征：非癌样本的ScfDNA在启动子、外显子区域的峰数量更多（n=10，p=0.0447），AUROC=0.67。
4.3 核心成果与创新性
功能关联：ScfDNA的多维度特征可有效区分胃癌与非癌样本，其中峰谷指数的区分能力最优（AUROC=0.93），多特征整合后的PCA-PC1轴区分效能达p<0.0001。
创新性：（1）首次系统解析ScfDNA的多维度特征（片段组学+末端基序+微生物组+功能元件），发现其“锯齿状”片段分布、差异末端基序及微生物组变化是胃癌的潜在生物标志物；（2）首次验证单链文库测序（BRcfDNA-seq）在ScfDNA分析中的优势，解决了传统方法对单链/超短片段的遗漏问题；（3）为唾液作为胃癌液体活检生物流体提供了cfDNA层面的证据，补充了现有蛋白/RNA标志物的不足。
本研究通过多维度特征分析，证实ScfDNA的非突变特征可作为胃癌液体活检的潜在生物标志物，为胃癌的非侵入性诊断提供了新方向。未来需在更大样本量中验证特征的稳定性，并探索其与临床病理参数（如肿瘤分期）的关联，进一步推动临床转化。