1. 领域背景与文献引入
文献英文标题：Nanopore sequencing for the screening of myeloid and lymphoid neoplasms with eosinophilia and rearrangement of PDGFRα, PDGFRβ, FGFR1 or PCM1-JAK2；发表期刊：Biomarker Research；影响因子：未公开；研究领域：髓系和淋系肿瘤伴嗜酸性粒细胞增多症的分子诊断。
嗜酸性粒细胞增多症是一组病理生物学与临床表型高度异质性的疾病，其核心驱动事件是基因融合——涉及血小板衍生生长因子受体α（PDGFRα）、PDGFRβ、成纤维细胞生长因子受体1（FGFR1）或Janus激酶2（JAK2）的融合，是世界卫生组织（WHO）定义的“髓系和淋系肿瘤伴嗜酸性粒细胞增多症（MLN-Eo）”的关键生物标志物。此类融合通过持续激活酪氨酸激酶信号通路，驱动肿瘤细胞增殖与嗜酸性粒细胞异常增多，因此准确检测融合事件是MLN-Eo诊断与靶向治疗（如伊马替尼）的核心。
当前临床诊断的痛点在于：现有细胞遗传学方法（如荧光原位杂交，FISH）依赖“已知融合伙伴”的探针——若患者携带罕见/未知融合伙伴（如CCDC88C-PDGFRβ），FISH无法检测；而RNA测序虽能覆盖更多融合类型，但需提取细胞RNA，周转时间>72小时且生物信息学分析复杂。为解决这些技术瓶颈，本研究探索纳米孔（nanopore）长读长测序技术的潜力，旨在从全血DNA出发，快速、全面筛查原发性嗜酸性粒细胞增多症患者的基因融合。
2. 文献综述解析
本研究综述围绕“MLN-Eo现有诊断技术的局限性”展开，按“细胞遗传学（FISH）-RNA分析”的逻辑分类评述。现有研究的关键结论是：FISH作为一线诊断工具，能直接可视化染色体异常，但“已知融合伙伴依赖”是其致命缺陷——仅能检测探针覆盖的融合（如ETV6-PDGFRβ），无法识别未知伙伴；RNA分析通过检测融合转录本，覆盖度更高，但需新鲜细胞样本，RNA提取与测序的周转时间无法满足临床快速诊断需求，且融合转录本的拼接分析需专业人员解读。
现有方法的局限性可概括为“已知性依赖”（FISH）与“技术门槛+时间成本”（RNA分析）。本研究的创新价值在于：利用纳米孔测序“长读长”（读长可达数十kb）的优势，直接从全血DNA中检测基因融合——无需依赖已知伙伴，也无需提取RNA；且整个流程（DNA提取→结果分析）仅需60小时，大幅缩短诊断时间，为MLN-Eo的快速精准诊断提供新范式。
3. 研究思路总结与详细解析
本研究整体框架为“样本入组→DNA提取→纳米孔测序→双算法融合分析→FISH验证”，核心目标是开发“MLN-Eo基因融合快速筛查技术”，解决“纳米孔测序能否克服现有方法局限性”的科学问题。
3.1 样本收集与临床特征整理
实验目的是纳入符合条件的原发性嗜酸性粒细胞增多症患者，明确基线特征。方法细节为入组12例患者（7男5女），排除家族性/继发性嗜酸性粒细胞增多症，收集诊断时全血样本，记录年龄、绝对嗜酸性粒细胞计数（AEC）、白细胞计数等数据，并通过PCR验证无JAK2V617F、MPLW515或CALR exon9突变（n=12）。结果显示：患者中位年龄48岁（25-85岁），中位AEC 1.4×10⁹/L（1.1-6.7×10⁹/L），中位白细胞计数14.45×10⁹/L（7.3-105×10⁹/L），为后续分析提供临床背景。产品关联：文献未提及具体样本收集产品，领域常规使用EDTA抗凝管。
3.2 全血DNA提取与纳米孔测序文库制备
实验目的是获取高质量DNA用于测序。方法细节为从全血中提取基因组DNA（常规酚-氯仿法或商业试剂盒），按Oxford Nanopore标准流程制备文库——将DNA片段化至~20kb，连接测序接头后加载至MinION/PromethION平台。结果显示：DNA浓度≥50ng/μL（符合测序要求），文库片段大小集中在15-25kb（琼脂糖凝胶验证）。产品关联：文献未提及具体试剂盒，领域常规使用Qiagen DNeasy Blood & Tissue Kit提取DNA，Oxford Nanopore SQK-LSK109制备文库。
3.3 拷贝数变异分析（Nano-GLADIATOR）
实验目的是检测PDGFRα相关的间质缺失（如FIP1L1-PDGFRα融合的驱动事件——chr4(q12)缺失）。方法细节为使用Nano-GLADIATOR软件，将基因组分成10kb窗口，计算每个窗口的读长覆盖度，转换为log2拷贝比（log2=0代表二倍体，<0代表缺失），通过KaryoploteR可视化。结果显示：3例患者检测到chr4(q12)间质缺失（如样本#1的del4），缺失区域log2拷贝比降至-0.5以下（n=3，P<0.05，基于段内标准化信号标准差），提示PDGFRα区域基因组物质丢失——这是FIP1L1-PDGFRα融合的典型特征。对应Fig.1 A，
。产品关联：使用KaryoploteR（R包）可视化，无商业产品。
3.4 嵌合读段分析（Sniffles）
实验目的是检测染色体易位导致的融合（如ETV6-PDGFRβ、ZMYM2-FGFR1）。方法细节为使用Sniffles软件，识别“嵌合读段”（同时映射到两条染色体的读段），通过Ribbon可视化。结果显示：样本#4检测到t(5;12)(q32;p13)易位，嵌合读段长18108bp（8756bp来自chr12的ETV6，9352bp来自chr5的PDGFRβ），融合断点位于PDGFRβ内含子10（nt=15776）与ETV6内含子4（nt=218066）；样本#5检测到t(5;14)(q32q32)易位（CCDC88C-PDGFRβ融合），嵌合读段长32847bp（22736bp来自PDGFRβ，9111bp来自CCDC88C）；样本#6-7检测到t(8;13)(p11;q12)易位（ZMYM2-FGFR1融合），嵌合读段覆盖FGFR1与ZMYM2的融合区域。对应Fig.1 B，
。产品关联：使用Ribbon（Python工具）可视化，无商业产品。
3.5 结果验证（FISH金标准）
实验目的是验证纳米孔测序的准确性。方法细节为对12例患者样本进行FISH检测——使用针对PDGFRα/β、FGFR1的探针（如Vysis PDGFRβ双color探针）。结果显示：纳米孔测序检测的7例融合（3例chr4缺失、2例PDGFRβ易位、2例FGFR1易位）与FISH完全一致，Pearson’s R²=1（n=12），提示结果准确可靠。产品关联：文献未提及具体探针，领域常规使用Abbott Molecular Vysis系列探针。
4. Biomarker研究及发现成果解析
本研究的Biomarker是MLN-Eo相关的基因融合，包括三类：① PDGFRα间质缺失（del4）；② PDGFRβ易位（ETV6/CCDC88C-PDGFRβ）；③ FGFR1易位（ZMYM2-FGFR1）。筛选逻辑为“纳米孔无偏检测→FISH验证”——通过长读长测序直接识别所有可能的融合，再用金标准确认。
Biomarker的来源是“原发性嗜酸性粒细胞增多症患者的全血DNA”，无需分离骨髓或外周血单个核细胞（PBMC），简化了样本处理。验证方法包括“生物信息学交叉验证”（Nano-GLADIATOR与Sniffles的结果一致）与“金标准验证”（FISH）。特异性方面，纳米孔与FISH一致性100%（R²=1），提示特异性高；敏感性方面，12例患者中检测到7例融合，与FISH结果完全重叠（因样本量小，需更大队列验证）。
核心成果可概括为三点：① 未知融合检测能力——如样本#5的CCDC88C-PDGFRβ融合（罕见未知伙伴），FISH无法检测，但纳米孔通过嵌合读段直接识别；② 快速性——从DNA提取到结果分析仅需60小时，远快于RNA测序（>72小时）；③ 样本兼容性——直接使用全血DNA，无需细胞样本，适合临床常规检测。创新性在于“首次将纳米孔测序应用于MLN-Eo基因融合筛查”，解决了现有方法“已知性依赖”与“时间成本高”的问题，为MLN-Eo的快速精准诊断提供了新工具。