1. 领域背景与文献引入
文献英文标题：ICOS DNA methylation regulates melanoma cell-intrinsic ICOS expression, is associated with melanoma differentiation, prognosis, and predicts response to immune checkpoint blockade；发表期刊：Biomarker Research；影响因子：4.8（2022年）；研究领域：黑色素瘤免疫治疗与表观遗传生物标志物。
黑色素瘤是皮肤癌中最致命的亚型，全球发病率呈上升趋势。免疫检查点阻断（ICB）疗法（如PD-1、CTLA-4抑制剂）的应用彻底改变了晚期黑色素瘤的治疗格局，使部分患者获得长期生存，但仅30%-40%的患者能产生持久响应，且存在免疫相关不良反应。因此，亟需可靠的生物标志物预测治疗响应、指导个体化治疗。
诱导性T细胞共刺激分子（ICOS，CD278）是CD28家族的关键成员，主要表达于激活的T细胞（如CD8+细胞毒性T细胞、调节性T细胞），通过与配体ICOSL结合调控T细胞活化和肿瘤免疫微环境。现有研究表明，ICOS+ T细胞数量与ICB响应相关，但肿瘤细胞自身是否表达ICOS、其表达受何种机制调控，以及能否作为黑色素瘤预后/预测生物标志物仍不明确。此外，表观遗传修饰（如DNA甲基化）对ICOS的调控尚未被系统研究。
本研究针对上述空白，旨在揭示黑色素瘤细胞内源性ICOS的表达受DNA甲基化调控的机制，并验证ICOS甲基化及mRNA表达作为黑色素瘤预后和ICB治疗预测生物标志物的价值，为个体化免疫治疗提供新靶点和生物标志物。
2. 文献综述解析
作者通过梳理ICOS研究现状，指出三大核心局限：1. 现有研究聚焦ICOS在免疫细胞中的功能，肿瘤细胞内源性ICOS的表达及功能未被阐明；2. ICOS的表观遗传调控（如DNA甲基化）尚未被研究；3. 黑色素瘤ICB治疗缺乏可靠的生物标志物（如PD-L1、TMB存在局限性）。
本研究的创新点在于：
1. 首次揭示黑色素瘤细胞内源性ICOS的表达受DNA甲基化调控；
2. 系统验证ICOS甲基化及mRNA表达作为黑色素瘤预后和ICB治疗预测生物标志物的价值；
3. 发现肿瘤细胞内源性ICOS的核定位现象，提示其潜在的非经典功能（如基因调控）。
3. 研究思路总结与详细解析
本研究采用“临床队列-细胞模型-分子机制-临床关联”的闭环思路，结合多队列临床数据（TCGA、UHB ICB队列）、细胞系实验（A375）及分子技术（甲基化芯片、qRT-PCR、IHC），系统解析ICOS甲基化的调控机制及临床价值。
3.1 临床队列与细胞模型构建
实验目的：建立具有临床相关性的样本库及细胞模型，为后续研究提供基础。
方法细节：纳入4个临床队列：1. TCGA黑色素瘤队列（n=470，含甲基化、转录组及临床数据）；2. UHB ICB case/control队列（n=48，含接受ICB治疗的晚期黑色素瘤患者FFPE组织）；3. UHB ICB队列（n=123，含接受ICB治疗的晚期黑色素瘤患者FFPE组织）；4. Liu等的ICB队列（n=121，含ICB治疗患者转录组数据）。细胞模型采用人黑色素瘤细胞系A375（ATCC，RRID:CVCL_0132），经DSMZ认证无支原体污染，培养于含10%胎牛血清的RPMI 1640培养基（Thermo Fisher，货号21875059）。
结果解读：队列覆盖不同治疗状态（ICB vs 非ICB）及临床结局（响应 vs 进展），A375细胞低基线ICOS表达，适合验证甲基化调控。
产品关联：A375细胞系来自ATCC；培养基为Thermo Fisher的RPMI 1640（货号21875059）；支原体检测使用领域常规的MycoAlert试剂盒（Lonza）。
3.2 黑色素瘤中ICOS表达模式分析
实验目的：明确ICOS在黑色素瘤中的细胞来源及表达水平。
方法细节：通过TCGA队列RNA-seq数据（n=468）分析ICOS mRNA表达；利用Tirosh等的单细胞RNA-seq数据（n=4645，来自19例黑色素瘤组织）分析细胞类型特异性；通过GDSC数据库（n=33）验证肿瘤细胞内源性ICOS mRNA表达。
结果解读：TCGA队列中ICOS mRNA表达异质性强（0-647.89 n.c.，中位数24.83 n.c.），且与免疫细胞浸润标志物（如CD8A、IFNG）显著正相关（ρ=0.859，P<0.001）；单细胞RNA-seq显示ICOS主要在T细胞中高表达，少数CD45-肿瘤细胞也有低表达；GDSC细胞系中ICOS mRNA表达可变（0-2.44 RMA，中位数0.057 RMA），证实肿瘤细胞可内源性表达ICOS。
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3.3 药理去甲基化诱导ICOS表达验证
实验目的：验证DNA甲基化对肿瘤细胞内源性ICOS表达的调控作用。
方法细节：用10μM 5-aza-2-脱氧胞苷（decitabine，Abcam，货号ab120842）处理A375细胞168小时（每24小时换液），未处理细胞为对照。通过qRT-PCR（Vazyme，HiScript II Q RT SuperMix，货号R222）检测ICOS mRNA，流式细胞术（abcam，anti-ICOS抗体，clone SP98，货号ab105227）及免疫组化（IHC，同前抗体）检测蛋白表达，扁桃体组织为阳性对照。
结果解读：decitabine处理后，A375细胞的ICOS mRNA表达显著升高（ΔCT降低，n=6，P<0.001），蛋白表达也显著增加（平均荧光强度MFI升高，n=6，P<0.05），且蛋白主要定位于细胞核（与扁桃体组织的膜定位不同）。
产品关联：decitabine来自Abcam（货号ab120842）；qRT-PCR试剂盒为Vazyme的HiScript II（货号R222）；ICOS抗体为abcam的SP98（货号ab105227）；流式细胞术使用BD FACSCanto™仪器。
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3.4 ICOS基因座甲基化模式分析
实验目的：解析ICOS基因座不同CpG位点的甲基化水平及细胞类型特异性。
方法细节：通过Illumina HumanMethylation450/EPIC BeadChip检测TCGA队列（n=470）、UHB ICB case/control队列（n=48）及Hannon等的免疫细胞（n=28，含CD4+ T细胞、CD8+ T细胞、单核细胞）的甲基化水平，分析ICOS基因座的7个CpG位点（CpG1-7，覆盖启动子、第一外显子及基因体）。
结果解读：TCGA队列中，CpG1-3（启动子上游）甲基化水平高（均值>80%），CpG4-5（启动子及第一外显子）甲基化水平低（均值<70%）；免疫细胞（尤其是CD4+ T细胞）的CpG2甲基化水平显著低于黑色素瘤细胞（P<0.001）；UHB队列中，CpG4-5甲基化水平与肿瘤细胞内源性ICOS表达负相关。
< img src="https://media.springernature.com/lw685/springer-static/image/art%3A10.1186%2Fs40364-023-00508-2/MediaObjects/40364_2023_508_Fig4_HTML.png" alt="ICOS基因座CpG位点结构" >
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3.5 甲基化与ICOS转录活性的关联
实验目的：验证DNA甲基化对ICOS转录的调控作用。
方法细节：通过Spearman相关分析TCGA队列（n=468）中CpG位点甲基化与ICOS mRNA的相关性，及GDSC细胞系（n=33）中CpG4-5甲基化与ICOS mRNA的相关性。
结果解读：TCGA队列中，CpG2甲基化与ICOS mRNA呈强负相关（ρ=-0.536，P<0.001）；GDSC细胞系中，CpG4-5甲基化与ICOS mRNA呈强负相关（ρ=-0.742，P<0.001），证实甲基化抑制ICOS转录。
3.6 甲基化与临床结局的关联验证
实验目的：验证ICOS甲基化及mRNA表达对黑色素瘤预后及ICB响应的预测价值。
方法细节：通过Cox比例风险模型、Kaplan-Meier分析及log-rank检验，分析TCGA队列（非ICB患者，n=447）的总生存期（OS）、Liu等的ICB队列（n=121）的无进展生存期（PFS）及响应率、UHB ICB队列（n=123）的OS及PFS。
结果解读：
- TCGA队列：高ICOS mRNA表达与良好OS相关（HR=0.996，95%CI 0.993-0.999，P=0.006）；低CpG4-5甲基化与不良OS相关（HR=0.227，95%CI 0.091-0.563，P=0.001）；
- Liu队列：高ICOS mRNA表达与ICB响应率高（P<0.001）及PFS延长相关（HR=0.847，95%CI 0.725-0.990，P=0.036）；
- UHB队列：低CpG4-5甲基化与ICB响应率高（P=0.026）及PFS延长相关（HR=8.095，95%CI 1.337-49.021，P=0.023）。
< img src="https://media.springernature.com/lw685/springer-static/image/art%3A10.1186%2Fs40364-023-00508-2/MediaObjects/40364_2023_508_Fig6_HTML.png" alt="ICOS甲基化及mRNA表达与临床结局的关联" >
4. Biomarker研究及发现成果解析
Biomarker定位与筛选逻辑
Biomarker类型：ICOS DNA甲基化（CpG4-5，表观遗传生物标志物）、ICOS mRNA表达（转录生物标志物）。
筛选验证逻辑：
1. 队列关联：通过TCGA队列分析甲基化与mRNA的相关性；
2. 细胞验证：通过A375细胞验证甲基化对ICOS表达的调控；
3. 临床验证：通过UHB、Liu队列验证与ICB响应及生存的关联。
研究过程与核心成果
Biomarker来源：临床黑色素瘤组织（FFPE）、细胞系。
验证方法：甲基化检测（qMSP、甲基化芯片）、mRNA检测（qRT-PCR、RNA-seq）、蛋白检测（IHC、流式细胞术）。
核心成果：
1. 预后价值：
- 非ICB患者：高ICOS mRNA表达与良好OS相关（HR=0.996，P=0.006）；低CpG4-5甲基化与不良OS相关（HR=0.227，P=0.001）；
2. 预测价值：
- ICB患者：高ICOS mRNA表达与响应率高（P<0.001）、PFS延长相关（HR=0.847，P=0.036）；低CpG4-5甲基化与响应率高（P=0.026）、PFS延长相关（HR=8.095，P=0.023）；
3. 调控机制：肿瘤细胞内源性ICOS表达受DNA甲基化调控，可被decitabine诱导（mRNA及蛋白表达升高）。
临床意义
ICOS甲基化及mRNA表达为黑色素瘤提供了双重生物标志物：
- 非ICB患者：通过ICOS mRNA或CpG4-5甲基化判断预后；
- ICB患者：通过CpG4-5甲基化预测响应，高响应患者可优先选择ICB治疗，低响应患者可考虑联合表观调控（如decitabine）增强ICOS表达，提高治疗效果。
本研究首次系统解析了ICOS在黑色素瘤中的表观调控机制及临床价值，为个体化免疫治疗提供了新的生物标志物和靶点。