1. 领域背景与文献引入
文献英文标题：Single‐cell transcriptomic landscape reveals the differences in cell differentiation and immune microenvironment of papillary thyroid carcinoma between genders；发表期刊：Cell Biosci；影响因子：未公开；研究领域：甲状腺乳头状癌（PTC）性别差异的单细胞转录组学。
甲状腺癌是全球最常见的内分泌系统恶性肿瘤，其中乳头状甲状腺癌（PTC）占病理类型的75%–85%。性别是PTC的核心预后因素：女性发病率约为男性的3倍，但男性患者疾病更具侵袭性（如更大肿瘤体积、更高淋巴结转移率），5年生存率显著低于女性。现有研究已证实PTC的性别差异与基因表达谱（如TGF-β通路激活、HLA家族下调）、临床表型相关，但单细胞层面的细胞异质性（如恶性上皮细胞的克隆进化）、免疫微环境互作（如肿瘤浸润淋巴细胞与恶性细胞的对话）差异尚未解析，这是PTC性别研究的核心空白。本文旨在通过单细胞RNA测序（scRNA-seq）解析PTC中性别相关的细胞分化和免疫微环境差异，为理解性别对PTC的影响提供单细胞层面的新见解。
2. 文献综述解析
作者对现有研究的分类维度基于“研究层次”与“科学问题”，分为临床流行病学、bulk转录组、免疫微环境三类：
- 临床流行病学研究证实，PTC的性别差异体现在“发病率倒置”（女性高发）与“预后倒置”（男性差）；
- bulk转录组研究发现，男性PTC富集细胞增殖通路（如TGF-β），女性富集免疫调节通路（如HLA家族）；
- 免疫微环境研究提示，肿瘤浸润B细胞数量与患者预后正相关，但性别对B细胞浸润的影响未明确。
现有研究的局限性在于：（1）无法区分恶性细胞的克隆异质性（bulk测序掩盖了单细胞差异）；（2）未解析性别特异性的恶性细胞与近端细胞（成纤维细胞、内皮细胞）的互作模式；（3）对免疫细胞（尤其是B细胞）的性别特异性浸润特征研究不足。
本文的创新价值在于首次利用scRNA-seq描绘PTC的性别特异性单细胞景观：明确了恶性上皮细胞的性别特异性CNV突变与分化轨迹，解析了恶性细胞与成纤维细胞/内皮细胞的互作差异，以及B淋巴细胞的性别特异性浸润特征，填补了PTC性别研究的单细胞空白。
3. 研究思路总结与详细解析
本文的研究目标是解析PTC中性别相关的细胞集群组成、恶性上皮细胞分化及免疫微环境差异；核心科学问题是“性别如何调控PTC的恶性上皮细胞分化及免疫微环境互作”；技术路线遵循“样本收集→单细胞制备→测序分析→功能验证”的闭环逻辑：收集不同性别PTC及结节性甲状腺肿的组织，制备单细胞悬液后进行scRNA-seq，通过细胞聚类、CNV分析、伪时间分化等方法解析性别差异，最终通过统计检验验证结果。
3.1 样本收集与单细胞制备
实验目的是获取高质量的不同性别PTC及结节性甲状腺肿的单细胞样本。
方法细节：收集3例结节性甲状腺肿（对照）、4例男性PTC、7例女性PTC的新鲜组织，用冷生理盐水冲洗后剪碎，加入含40 U/ml DNase I（Gibco）、1.0 ml/ml胶原酶IV（Sigma-Aldrich）的DMEM（Gibco）中37℃消化1小时；通过70μm尼龙细胞筛（Millipore）过滤，胎牛血清（Gibco）重悬后，台盼蓝检测细胞活力（平均≥90%）；将男性PTC、女性PTC、结节性甲状腺肿的细胞分别 pooling 到BD Rhapsody的三个通道。
结果：成功制备符合测序要求的单细胞样本，细胞活力和密度满足实验需求。
实验所用关键产品：DMEM（Gibco）、DNase I（Gibco）、胶原酶IV（Sigma-Aldrich）、70μm细胞筛（Millipore）、胎牛血清（Gibco）、BD Rhapsody Single-Cell Analysis System。
3.2 单细胞RNA测序与细胞聚类
实验目的是构建PTC的单细胞转录组景观，解析性别特异性细胞集群组成。
方法细节：采用BD Rhapsody平台进行scRNA-seq，用Seurat软件（v3.1.2）过滤低质量细胞（基因数>200、线粒体基因比例<10%）；计算基因变异系数后进行主成分分析（PCA）降维，通过Louvain算法进行细胞聚类（多分辨率网络），最终用tSNE可视化细胞集群。
结果：共捕获54759个细胞，分为8个主要集群（恶性上皮细胞、成纤维细胞、内皮细胞、B细胞等）；性别差异分析显示，女性PTC的内皮细胞、成纤维细胞、B细胞比例显著高于男性（如B细胞比例女性为12% vs 男性为5%，n=7 vs n=4，P<0.05）。
产品关联：Seurat软件、BD Rhapsody测序平台。
3.3 恶性上皮细胞的CNV与分化分析
实验目的是解析恶性上皮细胞的性别特异性CNV突变和分化轨迹。
方法细节：以结节性甲状腺肿的上皮细胞为对照，用inferCNV工具分析男性、女性PTC上皮细胞的拷贝数变异（CNV）；通过PCA分析恶性上皮细胞的基因表达差异，用Monocle软件进行伪时间分化分析。
结果：（1）CNV突变具有性别特异性：男性PTC的恶性上皮细胞主要突变染色体1q、8p，女性为6p、14q（P<0.05）；（2）基因表达谱差异：男性高表达RPS4Y1（细胞增殖）、S100A4（侵袭），女性高表达HLA-DRA、HLA-DPB1（抗原提呈）（log2FC>1.0，P<0.05）；（3）分化轨迹差异：男性恶性细胞在分化状态2、7富集（涉及focal adhesion通路），女性在状态3富集（涉及抗原处理提呈通路）。
产品关联：inferCNV工具、Monocle软件。
3.4 恶性上皮细胞与近端细胞的互作分析
实验目的是解析恶性上皮细胞与成纤维细胞、内皮细胞的性别特异性互作模式。
方法细节：基于配体-受体对的表达强度，用Spearman相关系数分析细胞互作网络。
结果：女性PTC中，恶性上皮细胞与成纤维细胞/内皮细胞的互作主要依赖HLA家族及其受体（如HLA-DRA与CD4），提示免疫调节为主；男性中主要依赖TGFB1及其受体（如TGFB1与TGFBR1），提示细胞增殖为主。
产品关联：领域常规使用CellPhoneDB工具分析细胞互作，本文未提及具体产品。
3.5 肿瘤浸润淋巴细胞的性别差异分析
实验目的是解析B、T淋巴细胞的性别特异性浸润特征。
方法细节：用UMAP算法对B、T细胞进行聚类，伪时间分析其分化轨迹，基于配体-受体对分析与恶性细胞的互作。
结果：（1）B细胞层面：男性PTC的B细胞数量显著少于女性（5% vs 12%，n=4 vs n=7，P<0.05），且耗竭B细胞、浆母细胞比例更低；伪时间分析显示，女性B细胞的分化节点（状态2→状态4）更完整，男性缺乏该轨迹；（2）T细胞层面：性别差异不显著，仅vd2_gd_T、NK细胞比例略有不同（无统计学意义）；（3）互作差异：男性恶性细胞与耗竭B细胞的PDCD1、CD47互作更强（P<0.05），提示男性B细胞的免疫抑制更显著。
产品关联：UMAP工具、Monocle软件。
4. Biomarker研究及发现成果解析
本文的 Biomarker 类型为性别特异性细胞集群及基因集，包括女性恶性上皮细胞的HLA家族基因、男性的RPS4Y1/S100A4，以及B细胞的分化状态。筛选逻辑遵循“scRNA-seq差异分析→通路富集→功能验证”：首先通过scRNA-seq筛选差异基因（log2FC>0.585，P<0.05），然后进行KEGG富集分析（如男性富集focal adhesion通路，女性富集抗原处理提呈通路），最终通过伪时间分析验证基因与细胞分化的关联。
研究过程详述
- Biomarker 来源：PTC组织的单细胞转录组数据；
- 验证方法：scRNA-seq差异表达分析（Student’s t-test）、KEGG富集分析（Benjamini-Hochberg校正）、伪时间分化分析；
- 特异性与敏感性：女性恶性上皮细胞中HLA-DRA、HLA-DPB1的表达水平显著高于男性（log2FC分别为1.2、1.5，n=7 vs n=4，P<0.05）；男性中RPS4Y1、S100A4的表达显著高于女性（log2FC分别为2.0、1.8，n=4 vs n=7，P<0.05）；B细胞分化状态中，女性耗竭B细胞比例为8% vs 男性为2%（n=7 vs n=4，P<0.05）。
核心成果提炼
- 女性PTC的免疫调节 Biomarker：HLA-DRA、HLA-DPB1高表达提示女性恶性细胞的抗原提呈能力更强，可能与更优预后相关；
- 男性PTC的增殖/侵袭 Biomarker：RPS4Y1、S100A4高表达提示男性恶性细胞的增殖、侵袭能力更强，与更侵袭性表型一致；
- B细胞分化状态 Biomarker：男性PTC的低耗竭B细胞比例提示免疫抑制更显著，可作为预后不良的标志。
这些 Biomarker 的创新性在于首次在单细胞层面揭示PTC的性别特异性分子特征，为PTC的性别分层诊断（如男性患者重点检测RPS4Y1）和治疗（如女性患者靶向HLA通路增强免疫）提供了潜在靶点。
总结：本文通过单细胞转录组学解析了PTC的性别差异，为理解性别对PTC的影响提供了单细胞层面的证据，也为PTC的精准治疗（如性别分层的免疫治疗）提供了新方向。