1. 领域背景与文献引入
文献英文标题：iPepGen: a modular, Galaxy-based pipeline for immunopeptidogenomic neoantigen discovery and prioritization；发表期刊：Genome Biology；影响因子：未公开；研究领域：肿瘤免疫治疗-新抗原发现与免疫肽基因组学
新抗原是肿瘤免疫治疗的核心靶点之一，源于肿瘤细胞特有的基因组或转录组异常，能激活机体T细胞免疫反应且避免中枢免疫耐受，在过继性T细胞治疗、免疫检查点抑制剂治疗及肿瘤疫苗开发中具有重要价值。领域发展关键节点包括：下一代测序（NGS）技术的普及推动了新抗原的大规模预测，质谱（MS）基免疫肽组学技术实现了主要组织相容性复合体（MHC，人类为人类白细胞抗原HLA）结合肽的直接鉴定，而免疫肽基因组学整合NGS与MS数据成为当前新抗原精准发现的核心策略。当前研究热点聚焦于新抗原的精准预测模型优化、免疫原性评估及临床转化应用，但领域内仍存在未解决的核心问题：现有新抗原分析流程普遍对计算资源要求高、操作门槛高，缺乏用户友好的交互界面和系统培训资源；同时在非特异性酶切条件下的肽段鉴定效率不足，新抗原验证步骤的严谨性有待提升，限制了缺乏高级计算资源和生物信息学经验的研究者开展相关研究。针对这些局限性，本研究开发了基于Galaxy云平台的iPepGen模块化流程，旨在实现新抗原的高效发现、验证与优先级排序，降低操作门槛，为肿瘤免疫治疗的新抗原靶点发现提供实用工具。
2. 文献综述解析
作者对领域内现有研究的分类维度主要围绕新抗原分析的技术流程（预测、验证、优先级排序）及现有工具的核心局限性（计算资源依赖、操作门槛、鉴定效率、验证严谨性）展开。
现有新抗原预测工具主要基于NGS数据，利用MHC结合亲和力算法筛选潜在新抗原，其优势在于能快速大规模挖掘候选靶点，为免疫治疗提供潜在方向；但这类工具的局限性在于仅能提供预测结果，无法验证肽段的实际表达、加工及MHC呈递过程，且易受算法预测偏差影响，导致假阳性率较高。MS基免疫肽组学工具则能直接鉴定细胞表面呈递的MHC结合肽，提供实证数据支持新抗原的存在，优势在于结果可信度高；但该类工具面临非特异性酶切条件下数据库搜索空间过大、鉴定效率低下的挑战，常规蛋白组学工具难以适配。现有整合NGS与MS数据的免疫肽基因组学流程如NeoDisc等，虽功能全面，但需要本地高性能计算资源和专业技术维护，缺乏可视化交互界面和系统培训资源，限制了其广泛应用；同时部分流程在非特异性酶切条件下的肽段鉴定算法优化不足，新抗原验证步骤缺乏独立的二次验证环节，假阳性风险仍较高。
通过对比现有研究的未解决问题，本研究的创新价值凸显：首次基于Galaxy云平台构建了模块化的免疫肽基因组学流程，实现了新抗原分析全流程的云访问，无需本地计算资源即可使用；整合了FragPipe工具优化非特异性酶切条件下的肽段鉴定效率，引入PepQuery2实现新抗原的独立二次验证，提升了结果的严谨性；配套开发了交互式培训资源，降低了操作门槛，为缺乏生物信息学经验的研究者提供了可及的工具；同时流程支持模块化定制，可根据研究需求灵活组合模块，适应不同应用场景，填补了领域内兼具可及性、高效性和严谨性的新抗原分析工具的空白。
3. 研究思路总结与详细解析
本研究的整体目标是开发并验证一套基于Galaxy平台的模块化免疫肽基因组学流程iPepGen，实现肿瘤新抗原的从预测、鉴定、验证到优先级排序的全流程分析；核心科学问题是解决现有新抗原分析流程中计算资源要求高、操作门槛高、鉴定效率低及验证不严谨的痛点；技术路线遵循“需求分析→模块化流程构建→多数据集验证→定制化拓展”的闭环逻辑，通过构建五个核心模块，结合MPNST细胞系演示数据及公开肿瘤数据集验证流程的有效性，同时开发定制化工作流满足不同研究场景需求。
3.1 模块化流程构建与Galaxy平台部署
实验目的：构建覆盖新抗原分析全流程的模块化工作流，基于Galaxy云平台实现流程的可及性、可重复性与可扩展性，同时配套开发培训资源降低操作门槛。
方法细节：将iPepGen划分为五个核心模块，分别负责非参考新抗原预测、候选新抗原鉴定、新抗原肽谱匹配验证、新抗原序列可视化与分类、新抗原优先级排序；每个模块整合已验证的生物信息学工具（如Arriba、HISAT2、FragPipe等），并在Galaxy平台配置优化的工具参数；依托Galaxy Training Network（GTN）开发交互式学习路径，为用户提供分步操作指导。
结果解读：成功构建了五个独立且可整合的模块化工作流，通过欧洲Galaxy服务器提供云访问，用户无需本地计算资源即可启动分析；以MPNST细胞系的RNA-Seq和免疫肽组学数据为演示输入，各模块输出结果符合预期：模块1生成包含约290万条独特序列的定制蛋白数据库，模块2鉴定出123条非参考肽段，模块3验证得到19条高可信度新抗原肽段。
产品关联：文献未提及具体实验产品，领域常规使用NGS测序平台（如Illumina系列）、质谱仪（如Thermo Fisher Orbitrap系列）、Galaxy生物信息学平台及相关生物信息学工具（如HISAT2、FragPipe等）。
3.2 非参考新抗原预测模块（模块1）验证
实验目的：验证模块1对肿瘤细胞中多种非参考序列（基因融合、单氨基酸变异/插入缺失（SAV/InDel）、新转录本等）的预测能力，生成包含潜在新抗原的定制蛋白数据库。
方法细节：以MPNST细胞系的RNA-Seq数据为输入，采用三套平行工作流分别处理：使用Arriba算法检测基因融合事件；通过HISAT2比对、FreeBayes变异检测、CustomProDB翻译生成SAV/InDel来源的蛋白序列；利用StringTie组装新转录本，经GffCompare注释后翻译为蛋白序列；将所有非参考序列与UniProt人类参考序列、常见污染序列合并，去重后生成最终定制蛋白数据库。
结果解读：从MPNST细胞系RNA-Seq数据中鉴定出86个高可信度基因融合事件，三套工作流生成的子数据库合并去重后得到约290万条独特序列，其中融合、SAV/InDel、新转录本来源的序列占比合理，去重步骤有效减少了冗余（图2展示了各子数据库的规模及合并后的总数据库大小）。
产品关联：文献未提及具体实验产品，领域常规使用RNA-Seq建库试剂盒、NGS测序平台及基因融合检测、变异分析类生物信息学工具。
3.3 候选新抗原鉴定模块（模块2）性能验证
实验目的：验证模块2在非特异性酶切条件下对MHC结合肽段的鉴定效率，对比不同工具的性能差异，评估MSBooster算法对鉴定灵敏度的提升作用。
方法细节：以MPNST细胞系的免疫肽组学MS/MS数据为输入，使用FragPipe工具（整合MSFragger、MSBooster、Percolator、Philosopher等组件）在非特异性酶切模式下搜索模块1生成的定制蛋白数据库，设置FDR≤1%控制假阳性率；分别使用MaxQuant、PEAKS工具在相同条件下分析同一数据集，对比鉴定肽段数量；同时对比开启/关闭MSBooster算法的鉴定结果差异。
结果解读：FragPipe在非特异性酶切条件下的鉴定效率显著高于MaxQuant和PEAKS，处理包含290万条序列的数据库仅需不到2小时；MSBooster算法的使用使总肽段鉴定数平均增加35%，非参考序列鉴定数平均增加50%（图3A、3B）；从MPNST数据中鉴定出123条非参考肽段，符合新抗原候选的筛选标准。
产品关联：文献未提及具体实验产品，领域常规使用免疫沉淀试剂盒（如W6/32抗体用于MHC I类复合物富集）、质谱仪及肽段鉴定类生物信息学工具。
3.4 新抗原肽谱匹配验证模块（模块3）严谨性验证
实验目的：验证模块3对候选新抗原的独立二次验证能力，降低假阳性结果，提升新抗原候选的可信度。
方法细节：将模块2鉴定的123条候选新抗原肽段输入PepQuery2工具，以MS/MS谱图和UniProt参考序列为对照，进行肽段中心的谱图匹配验证，设置严格的统计阈值筛选高可信度匹配结果；同时使用BLAST-P工具比对NCBI参考数据库，确认肽段的新颖性。
结果解读：19条候选新抗原肽段通过PepQuery2的hyperscore验证和BLAST-P过滤，成为高可信度新抗原候选，有效控制了假阳性率；补充图S3展示了从预测到验证的全流程筛选逻辑，验证步骤显著提升了结果的严谨性。
产品关联：文献未提及具体实验产品，领域常规使用序列比对工具（如BLAST）及肽段谱图验证类生物信息学工具。
3.5 新抗原可视化与分类模块（模块4）功能验证
实验目的：验证模块4对新抗原肽段的基因组定位与分类能力，辅助解析新抗原的来源与潜在功能。
方法细节：使用PepPointer工具将模块3验证的19条新抗原肽段映射到GRCh38参考基因组的坐标，分类其基因组来源（编码区CDS、非翻译区UTR、内含子、基因间区等）；生成可直接导入整合基因组浏览器（IGV）和UCSC基因组浏览器的链接，实现新抗原的基因组可视化。
结果解读：19条新抗原肽段被定位到多种基因组区域，其中既有来自编码区的序列，也有来自非编码区的新转录本（表2总结了分类结果）；IGV可视化清晰展示了新抗原肽段对应的基因组区域及支持的RNA-Seq读长（图4），为新抗原的功能研究提供了线索。
产品关联：文献未提及具体实验产品，领域常规使用基因组浏览器（如IGV、UCSC Browser）及基因组注释类生物信息学工具。
3.6 新抗原优先级排序模块（模块5）与定制化流程验证
实验目的：验证模块5对新抗原的HLA结合亲和力与免疫原性预测能力，同时验证iPepGen流程的定制化拓展能力，适应不同研究场景需求。
方法细节：以MPNST细胞系RNA-Seq数据为输入，使用OptiType和Seq2HLA工具进行HLA基因分型，结合IEDB工具预测新抗原肽段与HLA的结合亲和力，将肽段分为强结合体（百分位排名≤0.5%）和弱结合体（0.5%-2%）；开发“一键式”全流程和模块2+3整合流程，分别应用于急性髓系白血病、黑色素瘤公开数据集，验证流程的通用性；同时在模块2中加入半胱氨酸谷胱甘肽化作为可变修饰，验证流程对翻译后修饰（PTM）肽段的鉴定能力。
结果解读：从MPNST数据中鉴定出8个HLA I类等位基因，13条新抗原肽段被预测为强结合体；“一键式”流程成功分析急性髓系白血病数据集，鉴定出6条非参考新抗原；模块2+3整合流程从黑色素瘤数据集中鉴定出93条验证的新抗原肽段，以及28条半胱氨酸谷胱甘肽化修饰肽段，验证了流程的灵活性与通用性。
产品关联：文献未提及具体实验产品，领域常规使用HLA分型工具、免疫原性预测工具及定制化生物信息学工作流。
4. Biomarker研究及发现成果解析
文献中涉及的Biomarker类型为肿瘤新抗原肽段，包括基因融合、SAV/InDel、新转录本来源的非参考肽段，以及带半胱氨酸谷胱甘肽化修饰的肽段；筛选/验证逻辑遵循“NGS数据预测非参考序列→MS/MS数据鉴定MHC结合肽→PepQuery2+BLAST-P验证新颖性→基因组定位与分类→HLA结合亲和力与免疫原性预测优先级排序”的完整链条，确保Biomarker的可信度与临床潜力。
Biomarker的来源为MPNST、急性髓系白血病、黑色素瘤细胞系的免疫肽组学样本；验证方法包括质谱仪直接鉴定MHC结合肽、PepQuery2独立谱图验证、BLAST-P序列新颖性比对；特异性与敏感性数据显示：模块2中FragPipe在非特异性酶切条件下的鉴定灵敏度显著高于MaxQuant和PEAKS，MSBooster算法提升了35%的总肽段鉴定数和50%的非参考序列鉴定数；模块3的二次验证有效控制了假阳性率，验证后的新抗原肽段假阳性率≤1%（文献未明确提供该数据，基于图表趋势推测）。
核心成果提炼：成功鉴定出19条MPNST细胞系的高可信度新抗原肽段，其中13条被预测为HLA强结合体，具备潜在的免疫治疗靶点价值；开发的iPepGen流程可高效处理不同肿瘤类型的数据集，鉴定出多种基因组来源的新抗原及PTM修饰肽段；创新性在于首次基于Galaxy云平台构建了模块化、可定制、易访问的免疫肽基因组学流程，解决了现有工具的计算资源依赖与操作门槛高的痛点，为缺乏生物信息学经验的研究者提供了实用的新抗原分析工具；统计学结果：FragPipe鉴定的肽段数显著多于MaxQuant（图3A，文献未明确提供P值，基于图表趋势推测），MSBooster的使用显著提升了鉴定灵敏度（图3B，文献未明确提供P值，基于图表趋势推测）；19条验证的新抗原肽段中，13条为HLA强结合体（占比68.4%，n=19，文献未明确提供P值，基于数据分布推测）。