STAR PROTOCOLS · 每日一篇 · 第 010 期
给线粒体装上"接触开关"再流式分选：FAMS 按接触强度拆解 ER–线粒体接触亚群
这篇方案解决什么问题
线粒体与内质网（ER）之间的膜接触位点（ERMCS）是细胞代谢的双向物质交换枢纽——钙、脂质、代谢物在此往来，应激反应也在此调度。但同一次分离得到的线粒体并不是一个模子刻出来的：有的与 ER 贴得紧，有的离得远，功能各不相同。传统差速离心把它们"一锅端"，根本分不出亚群。
密歇根大学 Shah / Lyssiotis 实验室的这套方案给出了细胞器层面的解法——FAMS（Fluorescently Activated Mitochondria Sorting，荧光激活线粒体分选）：先把 SPLICS_SER/MT 双分子互补 GFP（split-GFP）报告基因装进细胞——GFP 两个片段分别锚在 ER 与线粒体外膜上，只有两者距离 <10 nm 时才会重新组装发光；随后诱导表达、分离线粒体，用 Bigfoot 光谱流式分选仪的小颗粒检测模式，按 GFP 强度把"紧贴 ER"（SPLICSHI）与"疏远 ER"（SPLICSLO）的线粒体分开收，直接对接蛋白质组学——作者已验证 GFP 阳性线粒体显著富集 ER 相关蛋白。
整体流程一览
- 细胞培养（1 h/批）：SW480 / HT1080 常规维持，70–80% 汇合，300 g×3 min 消化收集；
- 构建 SPLICS 报告细胞系（约 3–4 周）：PiggyBac 转座子系统 + LTX 转染 → G418 杀伤曲线与筛选（7–14 天）→ Dox 诱导后 Bigfoot 分选 GFP+ 单克隆（96 孔，1 细胞/孔）与多克隆 → 扩繁 ≥15 个克隆并验证 ERMCS 诱导应答；
- FAMS 铺板（Day 1）：每条件 1–5 块 15 cm 皿，设无 Dox、溶媒、处理组三种条件；
- 染色与分离（约 1 h，全程低温）：200 nM MitoBrilliant 646 染 1 h → 刮刀收集 → 27G 针头抽打 10 次匀浆 → 700 g×10 min×2 → 7000 g×10 min 沉线粒体；
- 尺寸门 + 荧光门：0.2/0.5/1/2 μm FITC 微球定标（FSC-SPD 检测）→ RFP 门（总线粒体）→ MB646 门（染料阳性）→ SPLICSLO/SPLICSHI 门；
- 分析与分选：每样 ≥30,000 颗线粒体；分选 5000 events/s、4°C、Purity 模式，每群收 ≥6000 万颗 → 20,000 g×20 min×2 浓缩。
实验前准备
- 细胞系：SW480（ATCC CCL-228）、HT1080（ATCC CCL-121），低代次；
- 质粒：pPB-TRE-Dest-SPLICS_SER/MT（Tet-on 诱导、PiggyBac 系统）+ pCMV-HyPBase（转座酶）+ pPB-rtTAM2-IresNeo（抗性）+ pclbw-mitoTagRFP（Addgene #58425，总线粒体标记）；
- 杀伤曲线：G418 测试 200 μg/mL–2 mg/mL，找出 7–14 天全数杀灭的最低剂量；
- MIB 预冷：线粒体分离缓冲液当日配或 4°C 存 ≤1 周，用前预冷；
- 仪器确认：Bigfoot 光谱流式 + 小颗粒检测能力 + FSC 单颗粒检测器（SPD）；FlowJo v10.10.1 分析。
关键材料与试剂
| 试剂/材料 | 来源 | 货号 |
|---|---|---|
| MitoBrilliant 646（总线粒体染料） | Tocris Bioscience | 7700 |
| Mitotracker Deep Red FM（膜电位对照） | Invitrogen | M22426 |
| Rhod-2 AM（基质钙对照） | Invitrogen | R1244 |
| Fedratinib / Thapsigargin（ERMCS 诱导，阳性对照） | MedChem Express / Cayman | HY-10309 / 10522 |
| CCCP（去极化）/ CGP-37157（钙摄取） | Cayman Chemicals | 25458 / 15611 |
| 多西环素（Doxycycline hyclate，诱导报告表达） | Cayman Chemicals | 14422 |
| Lipofectamine LTX + PLUS | Invitrogen | 15338100 |
| 亚微米尺寸标准微球 0.2/0.5/1/2 μm（FITC） | Invitrogen | F13839 |
| G418 / Geneticin | Sigma-Aldrich / Gibco | A1720 / 10-131-035 |
| DMEM / Opti-MEM / HBSS / Trypsin-EDTA / PBS | Gibco | 11995065 / 31985088 / 14175095 / 25200114 / 10010023 |
| EDTA (0.5M) / EGTA / 蔗糖 / Tris / HEPES (1M) | Lonza / Cayman / Sigma / Fisher / Gibco | 51201 / 33963 / S9378 / BP-152 / 15630080 |
| 27G 针头 + 3 mL 注射器（匀浆） | Fisher Scientific | 14-826-48 / 14-823-435 |
| 5 mL 聚苯乙烯流式管 / 超速离心管 | Fisher / Beckman Coulter | 352054 / 344059 |
| Bigfoot 光谱流式分选仪 + SQ 软件 | Invitrogen | — |
试剂配方表
| 缓冲液 | 配方（组分 / 终浓度 / 用量） |
|---|---|
| 完全培养基（500 mL） | DMEM 445 mL（89%）+ FBS 50 mL（10%）+ 双抗 5 mL（1%） |
| 10× PBS（pH 7.4，1 L） | NaCl 80 g（1.4 M）+ KCl 2 g（26.8 mM）+ Na₂HPO₄ 14.4 g（101.4 mM）+ KH₂PO₄ 2.4 g（17.6 mM）定容 1 L |
| 分选缓冲液（250 mL） | HBSS 235.75 mL（94.3%）+ EDTA 0.5 mL（1 mM）+ FBS 5 mL（2%）+ 双抗 2.5 mL（1%）+ HEPES 6.25 mL（25 mM），0.22 μm 过滤 |
| 冻存液（10 mL） | FBS 9 mL（90%）+ 无菌过滤 DMSO 1 mL（10%） |
| Tris Base（1 M） | Tris Base 1 g + ddH₂O 8.255 mL |
| EGTA/Tris（0.5 M，pH 7.2） | EGTA 9.51 g + Tris Base 6.3 g + ddH₂O 至 50 mL |
| MIB 线粒体分离缓冲液（pH 7.4，500 mL） | EGTA/Tris 母液 1 mL（EGTA 1 mM、Tris 2 mM）+ Tris 1 M 4 mL（10 mM）+ 蔗糖 34.23 g（200 mM）+ HEPES 8 mL（16 mM），定容 500 mL，0.22 μm 过滤，预冷 4°C |
分步方案要点
① 细胞培养（1 h）
70–80% 汇合消化传代：PBS 洗 1 次 → 1 mL Trypsin-EDTA（10 cm 皿）→ 4 mL 培养基灭活 → 300 g×3 min。计数用 Multisizer 4e（HT1080/SW480 以 >10 μm 事件为活细胞门，计数值 ×400 = cells/mL）。
② 构建 SPLICS 报告细胞系（约 3–4 周）
- 转染：6 孔板 4 孔，50–60% 汇合贴壁 16–24 h；四组转染对照——PLUS only（无 DNA）、pDest only（300 ng SPLICS 质粒，无转座酶）、pBase only（160 ng HyPBase）、SPLICS（300 ng pDest + 160 ng pBase + NeoR 质粒）；LTX 50 μL / PLUS 10 μL 各 2.5 mL Opti-MEM，室温 5 min + 20 min 成复合物后加孔。
- G418 筛选：扩入 10 cm 皿，适宜剂量 G418（杀伤曲线定），CRITICAL每 2 天换液，7–14 天；对照皿死绝后 0.25× G418 维持。
- 单克隆分选：-Dox / +Dox / 未标记三皿（1:5，0.25× G418），+Dox 皿加 100 ng/mL 多西环素；24 h 后消化计数（10⁶ cells/mL 分选缓冲液）。EGFP 通道：FSC 触发 → SSC-A×FSC-A 圈主群 → FSC-A×FSC-W、SSC-A×SSC-W 双去黏连 → EGFP-A log10 直方图圈 GFP+；事件率 150–300/s；Multi Stream 模式、well sort limit=1、Mode=Single，96 孔板单细胞分选 + Infini sort 换板续分；再从 GFP+ 门收 ≥30,000 细胞入 5 mL 培养基得多克隆。
- CRITICAL克隆抉择：只留 GFP 可诱导、本底低、无异常表型的克隆；至少扩繁 15 个克隆。
- CRITICAL报告验证：进 FAMS 前用 ERMCS 诱导剂（thapsigargin / fedratinib）确认 GFP 升高。
③ FAMS 铺板（Day 1）
每条件 1–5 块 15 cm 皿（Day 3 达汇合）：HT1080 每 10 cm 皿 1×10⁶、SW480 2.5×10⁶；15 cm 皿分别为 3×10⁶ / 6×10⁶。三组条件：无 Dox 对照、Dox 溶媒对照、Dox + 目的处理。
④ 线粒体分离（约 1 h，全程低温）
- 染色：分离前 1 h 换含 200 nM MitoBrilliant 646 的预热完全培养基；
- 收集：37°C PBS 洗 2 次 → 冰上刮刀 + 5 mL 冰冷 PBS 收集 → 1000 g 沉淀 → 1 mL MIB 重悬 → 3 mL 注射器 + 27G 针头冰上抽打 10 次；
- 差速离心：700 g×10 min×2（去核与碎片）→ 7000 g×10 min、4°C 沉淀线粒体 + MAM；NOTE7000 g 沉淀明显深蓝于 700 g 沉淀 = 分级成功；
- 上机：500 μL MIB 重悬 → 加入已装 4 mL MIB 的流式管，冰上待检。
⑤ 尺寸门 + 荧光门设置
- 尺寸定标：触发 = 488-FITC；488 SSC 500 V、405 FSC-SPD 450 V、FITC 800 V。DI 水/MIB 跑背景并卡阈值；0.2/0.5/1/2 μm FITC 微球逐一定门（各 >2000 事件，电压锁定），混合微球圈 200 nm–2 μm 全范围 = final size gate，流速定标后降回 40%；
- RFP 门：双阴性对照定 TagRFP 电压，阴性群居中 10¹，圈 RFP−/RFP+；二维触发用 TagRFP 压线，只让真线粒体触发采集；
- MB646 门：RFP+ 染料阴性对照定 Alexa647，圈 MB646−/MB646+；用 RFP−+染料+ 对照验证二维触发有效；
- SPLICS 门：GFP 阴性对照定 FITC；溶媒对照圈 SPLICSLO，1 μM Fedratinib 处理组圈 GFP 增强区 = SPLICSHI。
⑥ 分析与分选
分析：每样 ≥30,000 颗线粒体（MB646+ 门设上限）。分选：流速渐升至 5000 events/s（对照确认参数不漂移）；2 支 15 mL 管各 5 mL 冷 MIB，Left 1 收 SPLICSLO、Right 1 收 SPLICSHI；样品加载与收集温度 4°C、Purity 模式；每群收 ≥6000 万颗。分选后 20,000 g×20 min、4°C×2 浓缩，液氮速冻或直接进下游。
预期结果
- 细胞系：Dox 可诱导、本底低的单克隆（多克隆异质性大，务必单克隆化）；
- 功能对照：25 μM CCCP 1 h + 50 nM Mitotracker Deep Red 验证去极化可测；50 μM CGP-37157 24 h + 5 μM Rhod-2 AM 验证基质钙可测；
- 产量：10 cm 皿 HT1080 >500 万颗、15 cm 皿 >1500 万颗；蛋白质组学需多皿并行；
- 金标准：蛋白质组学证实 GFP+ 线粒体富集 ER 相关蛋白（Chen et al.）。
定量与统计分析
阳性/阴性比例用 FlowJo v10.10.1 定量；同一细胞系内所有处理组必须使用完全一致的圈门策略；正式实验必须做生物学重复并做多重检验校正。
局限性
- 差速离心产物为粗线粒体制剂，混有 MAM 等膜组分；
- 流式高压 + 长时间离冰可能损伤蛋白/小分子，敏感下游需专门对照；
- SPLICS_S 只测 <10 nm 紧密接触；更大距离需电镜或 SPLICS_L（柔性连接子版，可测至 50 nm）佐证。
Troubleshooting
| # | 问题 | 关联步骤 | 原因与解决方案 |
|---|---|---|---|
| 1 | G418 筛选无效 | 6 | G418 弱于嘌呤霉素，依赖活跃增殖、需 7–14 天。低汇合维持（≤50% 更稳）；耐心等足周期；也可 Dox 诱导后直接分选 GFP+ 事件跳过筛选。 |
| 2 | 单克隆间报告差异大 | 8f | 表达水平天然异质。至少扩繁 15 个克隆逐一评估，与亲本群体对比择优；弃应激/异常表型克隆。 |
| 3 | 线粒体产量低 | 11 | 起始铺板量不足。先做预实验实测单皿产量，再反推皿数；注意处理条件会改变线粒体总量。 |
| 4 | 尺寸门圈不出 | 23 | 先跑纯 MIB 看背景，FITC 触发凸显微球；起始流速可到 100%，定标后降回 40% 复核；缓冲液过 0.1 μm 滤膜；必须用 FSC-SPD + SSC 作 Y 轴。 |
| 5 | 染料荧光过暗/过亮 | 10 | 浓度因细胞系而异，预实验多浓度测试：100–200 nM MitoBrilliant 646 染线粒体；50 nM Mitotracker Deep Red 读膜电位。 |
一句话总结
给线粒体装上"接触位点荧光开关"，再用流式分选把贴着 ER 的和疏远 ER 的线粒体分开收——细胞器水平的 FACS，把"群体平均"拆成"功能亚群"，蛋白质组学从此可以对线粒体"分群讨论"。