小鼠口腔插管：味觉溶液的精确递送

一、背景

• 研究味觉信息的检测与加工，绕不开一件事：把味觉溶液精准地呈递给动物。传统做法是让动物主动舔壶嘴（licking spout），但这就把"动机"卷了进来——为了促使动物喝水，往往要做限水（water restriction）等额外处理，这些操作本身会干扰味觉相关实验的解读。
• 口腔插管（intraoral cannula）技术可以被动、直接地把液体递进小鼠口腔，同时激活味觉、躯体感觉甚至伤害性感受系统及其相关的边缘通路。由于不依赖动物主动摄入，它消除了限水等动机操作的混杂效应；更重要的是，愉悦性刺激（如甜味）与厌恶性刺激（如酸味、苦味）都可以精确呈递，方便研究跨效价的神经响应。
• 在原文作者的配套研究中，他们正是用这套口腔插管递送味觉溶液，同步记录小鼠脑干唾液分泌核团（salivatory nuclei）的神经响应。

二、创新点

口腔插管最早在大鼠上发展出来，用于"味觉反应性"（taste reactivity）研究，后来虽然被搬到小鼠身上，但已发表描述往往一笔带过，缺乏可复现的方法细节。本 Protocol 的改进包括：

1. 整合式手术流程：把头杆固定、弯针引导导管走位、插管加固合并为一次手术完成。
2. 分步到位的操作细节：完整的逐步说明，可复现性大幅提升。
3. 兼容头固定与自由活动：插管位置经过优化，尽量不干扰行为视频记录、光纤光度法（fiber photometry）及其他头戴式记录/刺激装置。
4. 压力灌流精确控流：通过调节递送参数，既可以把摄入降到最低、只保留口腔感觉刺激，也可以允许动物吞咽、同时观察口腔与口后（post-oral）效应。

三、机构许可

所有动物操作必须符合所在机构实验动物管理与使用委员会（IACUC）批准的方案并遵守当地实验动物管理规定。原文操作遵循美国 NIH 实验动物管理与使用指南，并获西北大学 IACUC 批准。

四、关键资源表

五、实验前准备

器械灭菌（约 2 h）

1. 在手术前对所有器械与耗材进行灭菌。
   • 对细剪、镊子、J 弯针、骨刮匙、头杆和两把牵开器高压灭菌。

手术台准备（约 30 min）

2. 布置头杆固定与口腔插管所需的全部器械耗材。
   • 摆好细剪、镊、棉签、J 弯针、骨刮匙、导管管材、头固定杆和两把牵开器。
   • 打开立体定位仪上的加热垫，设置 35°C。
   • 在加热恢复区放一个干净笼盒，术后安置小鼠。
   • 备好眼膏、抗生素软膏、聚维酮碘、70% 乙醇、镇痛药（丁丙诺啡或丁丙诺啡长效制剂 ER、卡洛芬）、0.9% 生理盐水、牙科水泥和 502 胶水（super glue）。

注：立体定位仪用于在头杆固定到颅骨时稳定小鼠头部。

3. 插管操作准备：手术开始前备好头固定台、J 弯针与导管管材。
   • 备好头固定台并擦拭干净。
   • 用酒精棉片消毒 J 弯针和导管管材。
   • 把约 15 cm 长的导管管材套到 J 弯针上，管材需套过针的钝端约 2 mm。
   • 针尖蘸取抗生素软膏，放在无菌表面备用。

注：小鼠口腔并非无菌环境，针尖涂抗生素软膏有助于减轻口腔炎症、促进术后恢复。

六、分步方案

一、术前准备（约 30 min）

步骤 1：头杆固定前的动物准备——麻醉、备皮、上手术台。

1. 称重。
2. 按机构批准方案诱导麻醉：腹腔注射氯胺酮 + 赛拉嗪合剂（氯胺酮 100 mg/kg + 赛拉嗪 10 mg/kg）。
3. 10 min 后，按批准方案皮下注射卡洛芬 5 mg/kg，镇痛 + 抗炎。
4. 定期用捏趾反射监测麻醉深度。
5. 剃毛：从耳后到鼻部剃净头皮，两侧剃至眼与耳之间。
6. 把小鼠固定到立体定位仪上，用耳杆和门齿杆固定头部。
7. 双眼涂抹眼膏（防干燥）。
8. 用 70% 乙醇和聚维酮碘消毒头皮。
9. 切开头皮，去除颅骨表面皮肤。

注：本操作优先选择体重 20 g 以上的小鼠。导管管材将从颅骨右后侧穿出，该处头皮开口应稍大一些。

步骤 2：头杆固定——用牙科水泥把头固定杆粘到颅骨上。

1. 用骨刮匙刮颅骨表面。
2. 用 0.9% 生理盐水冲洗颅骨去除骨屑，再擦干。
3. 彻底干燥颅骨表面（1 min 以上）。
4. 在颅骨上涂少量牙科水泥，铺成薄层，覆盖暴露颅骨区域的左侧。
5. 放上头固定杆，较长的"手柄"（带螺纹孔的一端）朝左。
6. 在头固定杆上再覆牙科水泥，固定牢固，但不要侵占后续导管管材的出口区。
7. 等牙科水泥完全硬化。

注：充分刮除颅骨表面的薄层骨膜可显著提高牙科水泥附着强度。确认刮骨后没有出血——出血会降低水泥粘接力，可能导致实验中"头帽"脱落。头杆装好后，必须等水泥完全硬化再进行后续步骤。

二、置入导管管材（约 20 min）

步骤 3：固定头杆并摆位。

1. 用螺丝把头固定杆与头杆夹持器拧紧。
2. 把小鼠调成仰卧位，固定头杆稳定动物，把口部移到显微镜下。
3. 打开口腔。
4. 用牵开器固定下颌。
5. 把术者右侧的颊部向外侧牵开。

注：螺丝务必拧紧——一旦松动，进针过程中动物体位可能变化。牵拉下颌和舌头要轻柔，避免舌头瘀伤或损伤。颊部有粗大的神经走行，牵开时务必小心。

步骤 4：弯针引导导管从颊黏膜穿至头皮出口。

1. 显微镜下辨认左侧第二、三上臼齿（M2、M3）。
2. 将弯针小心刺入 M2/M3 旁边的颊黏膜（牙龈与颊部之间的软组织）。
3. 进针到约"口—头皮"一半距离时，取下牵开器，松开头杆夹持器，小心把小鼠翻回俯卧位，再拧紧夹持器固定。
4. 引导弯针直到针尖在头顶部附近眼/颊肌区域穿出。
5. 从出口侧剪断管材，保留 3–10 cm（见下方 Tip）。
6. 干燥管材出口周围区域。
7. 在管材出口处涂牙科水泥。
8. 用 29 G 针头在牙科水泥与管材之间的缝隙点上少量 502 胶水。
9. 重新把动物摆成仰卧位，从口腔侧修剪管材：保留长度以不影响进食、又不会缩回颊部为准，口内可见管长通常约 7 mm。
10. 拧下头固定杆，把动物移入恢复区。

注：进针前检查臼齿周围有无可见血管，避开血管进针；若不慎刺破出血，术后用棉签压迫口腔止血。J 弯针通常在眼与耳之间穿出；C 弯针通常在眼前部附近穿出。

三、术后监护与护理（术后最长 7 天）

步骤 5：术后护理——按批准方案监测动物，给予镇痛、抗感染与补液支持。

1. 按批准方案皮下注射丁丙诺啡长效制剂（ER），并腹腔注射 500 μL 0.9% 生理盐水补液。
2. 撤料至次日，降低口腔炎症风险。
3. 按批准方案给恩诺沙星（enrofloxacin），预防术后细菌感染或炎症。
4. 术后连续监测最长 7 天，检查炎症与管材固定情况。

四、味觉溶液递送（时长视实验而定）

步骤 6：经插管递送溶液。

1. 把灌流输出管接到外露的导管管材上。
2. 按实验需要设定压力（见 Tip）。
3. 按实验计划从灌流装置的储液池输送溶液。

七、预期结果

成功实施口腔插管后，可以把各种溶液高效、精确地直接递入小鼠口腔。以下味觉溶液可诱发稳健的行为与神经响应：

八、局限性

在原文作者的配套研究及初步观察中，鲜味刺激诱发的神经响应相对较弱。虽然 30 mM 谷氨酸单钾 + 1 mM IMP 混合液在鼓索神经全神经记录中能诱发稳健响应，但近期研究提示鲜味刺激对舌前部味觉通路的激活较弱。与此一致：用慢流速递送同一鲜味液（2–3 psi，促进摄入、增加舌后部暴露），在同一检测中能诱发出更强的响应。这些现象提示舌面不同区域的味觉编码存在出乎意料的区域差异，是未来值得深入的方向。

九、Troubleshooting

问题 1：实验中口内管材堵塞

动物进食或啃咬垫料可能堵住口腔内管材开口。

解决方案：

• 大多数情况下，用注射器经管材轻轻推注 0.9% 生理盐水即可冲开堵塞；若仍堵，等约 10 min 后再冲一次。
• 冲洗无效时，可在麻醉下手工清除：按步骤 3 摆位打开口腔，找到口腔内管材末端；若可见食物或垫料，小心取出；再用钝头针经管材轻轻注入少量 0.9% 生理盐水，溶解或顶出堵塞物。

注：冲洗时在口腔里放一个棉球，降低窒息风险。

十、参考信息

• Lead contact：Hojoon Lee（hojoon.lee@northwestern.edu）
• Technical contact：Gyujin Park（gyujin.park@northwestern.edu）
• 材料可获性：本研究未产生新的独特试剂。
• 数据与代码：原始与分析数据按合理要求提供；本研究未使用代码。
• 利益声明：作者声明无利益冲突。
• 资助：NIH（R21EB036732、R21DC022726、R01DC022740、R01AT013056）与 Whitehall Foundation。