水稻草矮病毒 RGSV：用褐飞虱做标准化传毒接种（Protocol for propagating and inoculating rice grassy stunt virus in rice plants using brown planthoppers）

一句话导读

水稻草状矮缩病毒（RGSV）没有现成的侵染性克隆，想给水稻"接种"病毒，只能靠它的唯一虫媒——褐飞虱。这篇 Protocol 把"养虫 → 带毒 → 接种 → 评病"全链条标准化，最关键的一招是分基因型单笼接种：每个基因型的苗单独关一笼、配等量带毒虫，从根上消除"虫子偏心挑食"带来的实验偏差。

背景

• RGSV 引起的水稻草状矮缩病是水稻上的重要病毒病，由带毒褐飞虱（Nilaparvata lugens Stål，BPH）以持久增殖型方式传播。感病植株典型表现为严重矮缩、分蘖过多、生长延迟、叶片淡绿，产量大幅下降。
• 由于 RGSV 缺乏常规可用的侵染性克隆系统，水稻实验接种必须依赖带毒褐飞虱传毒——虫子吃什么、吃多久、吃哪一株，直接决定接种效率。
• 现有报道很少处理一个隐藏的坑：不同水稻遗传背景会影响飞虱的着落、取食、存活和寄主偏好。把不同基因型的苗混养一笼，虫子会"挑好吃的"待着，导致不同基因型实际接受的毒量不同，抗病性评价被系统性带偏。
• 本 Protocol 的应对：统一苗龄、虫数、接种时长和关虫方式——同一基因型的苗放入独立透明塑料笼（细网盖防逃），接入等量带毒飞虱连续取食 3 天；接种期间每天轻扰虫子 2 次，促使虫子在苗间重新分布，减少"在一株上吃到底"的偏倚。

创新点

• 1. 分基因型腔室设计：每个基因型的幼苗单独放入一个自制透明夹笼，暴露于等量带毒飞虱，阻断虫媒在不同基因型间的直接选择。
• 2. 每日两次轻扰重分布：3 天接种期内人为干扰，避免局部取食不均。
• 3. 全链条时间表：从扩繁褐飞虱到病害评价给出推荐行动日（以浸种/移除成虫日为 Day 0），并强调按材料状态（虫龄同步度、苗 2–3 叶期窗口）而非死日期推进。
• 4. 可推广：类似的分基因型设计思路适用于其他"寄主基因型影响虫媒行为"的虫传水稻病毒接种体系。

实验进度总览（推荐时间线）

以"试验接种用种选种/浸种日"定义为 Day 0（与产卵后移除成虫同日）。各模块对应行动日如下（按原文实验室条件，实际应依温度、品种与虫群发育速率调整）：

生物安全与机构许可

本流程涉及 RGSV 毒源植物与带毒褐飞虱，所有操作须符合所在机构生物安全指南及当地/国家/区域对植物病原与虫媒的管理规定。毒源植物、带毒虫、mock 虫与健康苗必须分笼分区（防虫温室或独立生长室）饲养，防止虫媒逃逸、病毒扩散与交叉污染；接触过毒源或带毒虫的植株、虫子与一次性用品，须按机构批准程序去污后处置。

关键资源表

试剂配方

10× PBS

高压灭菌，室温保存 ≤1 个月。

PBS-T（洗膜缓冲液）

室温保存 ≤1 个月。

封闭液

现用现配，或 4°C 保存 ≤1 天。

自制装置

透明塑料夹笼（clip-cage）

用于褐飞虱饲养与 RGSV 接种。腔室带通风细网（保证气流）与推拉门（放虫/取虫），底部放入分格发芽板固定水稻幼苗位置（原文 Figure 1）。

自改装吸虫器

用于褐飞虱的收集与转移，把对虫体的物理损伤降到最低。组成：便携真空泵 + 真空表 + 硅胶软管 + 收集瓶 + 集虫管 + 移液枪头吸嘴（原文 Figure 2）。

实验前准备

RGSV 毒源植物的准备与分子验证

• 1. 获取 RGSV 感染水稻。
• a. 从田间采集症状典型植株，或使用实验室保种的 RGSV 感染苗。
• b. 挑选典型症状株：严重矮缩、分蘖过多、叶片淡绿、生长延迟。
• c. 候选毒源株在防虫温室内维持。
• 2. 取叶提 RNA。
• a. 每株取幼叶 50–100 mg。
• b. 液氮速冻，充分研磨。
• c. TRIzol 法提总 RNA：
• i. 研粉中加入 1 mL TRIzol，剧烈涡旋 1 min，室温静置 10 min。
• ii. 加入 TRIzol 体积 1/5 的氯仿，剧烈涡旋 1 min，室温 5 min。
• iii. 12,000 × g、4°C 离心 10 min。
• iv. 小心吸取上清至新 RNase-free 管。
• v. 加等体积异丙醇，−20°C 沉淀 30 min。
• vi. 12,000 × g、4°C 离心 10 min 收 RNA 沉淀。
• vii. 弃上清，75% 乙醇洗沉淀 2 次；短暂晾干，RNase-free 水溶解。
• 3. RT-qPCR 验证 RGSV 感染。
• a. 取 0.5–1 μg 总 RNA 合成 cDNA，按逆转录试剂盒说明用随机引物。
• b. 扩增 RGSV 特异片段（如 RGSV CP）。设健康水稻阴性对照、已知 RGSV 阳性（如有）阳性对照、水稻看家基因 Ubiquitin 内参。
• c. 判定：至少 2 个技术重复检出 RGSV 特异扩增且 Ct ≤ 35，同时 Ubiquitin 稳定扩增，判定该毒源株为 RGSV 阳性。
• d. 优先选择 RGSV 积累量较高（Ct 较低）的阳性株供虫子获毒——弱阳性株会降低获毒效率、增大实验波动。
• 注：感染率分析前应先用梯度稀释 cDNA 测引物效率；效率 90%–110%、R² > 0.99、熔解单峰、NTC 无扩增的引物对才可用于 RT-qPCR（标准曲线见原文 Figure S1）。
• CRITICAL：田间采集或实验室保种的毒源植物可能存在混合感染，用作毒源前必须分子验证；仅用确认 RGSV 阳性的植株供虫取食。

分步方案

一、健康褐飞虱种群的维持与同步（约 3 周）

本步建立足够数量的健康褐飞虱种群，供后续获毒与 mock 处理。虫量不足的实验室应先扩繁同步再做接种。

• 1. 选 TN1 等适合养虫的感虫品种饱满种子。
• 2. 清水冲洗，去掉漂浮、空瘪种子，只留浸泡后下沉的饱满粒。
• 3. 清水浸种约 2 天。
• 4. 沥水后催芽约 3 天，至芽长约 1 cm（Figure 3A）。
• 5. 将发芽种子转到铺湿滤纸的干净发芽板上（与夹笼配套，Figure 3B）。
• 6. 生长室培养：
• a. 温度 25°C–27°C；
• b. 相对湿度 50%–70%；
• c. 光周期 14–16 h 光 / 8–10 h 暗。
• 7. 育苗至适合喂虫的高度，通常约 5 cm（萌发后约 7 天，Figure 3C）。
• 8. 将苗板直接插入自制透明夹笼养虫（Figure 3D）。
• 9. 用自改装吸虫器把 100–150 头腹部明显膨大的抱卵雌成虫转到新鲜苗上。
• 10. 让雌成虫取食产卵约 3 天。
• 11. 产卵结束后，用吸虫器移除全部成虫。
• 12. 每天观察若虫孵化。在 25°C 实验室条件下，移除成虫后约 9 天可见白色初孵若虫。
• 注：9 天只是 25°C 下的近似孵化时间，不同实验室因温湿度、苗情、虫群状态而异——以"大量白色初孵若虫出现"为准，而非死天数。获毒前确认大多数虫为 1–2 龄若虫且活跃取食（1–2 龄若虫体型小、体色淡白至浅黄、翅芽不发育）。孵化迟缓或不同步时，可利用苗 2–3 叶期窗口每日观察、挑选更同步的若虫subset。
• 注：稳定虫群需数周建立；大规模接种要多备虫（转移、获毒、接种过程有损耗）。一般每个基因型至少 30 株苗、每苗 3–4 头若虫，再额外多备补偿损耗。
• CRITICAL：健康虫群必须与带毒虫、RGSV 毒源植物、已接种苗分开饲养，防止意外污染。

二、幼苗准备与分基因型 RGSV 接种（育苗 10–16 天 + 接种 3 天）

育苗须与虫子发育同步：带毒虫准备好时，苗恰好到合适叶龄。

• 14. 在成虫移除当日（步骤 11），从待测的每个水稻基因型中选饱满种子。
• 注：每个独立生物学重复，每品系至少准备 40 株苗——考虑到死苗、操作损耗等，保证最终每品系仍有 ≥30 株用于感染率统计。共做 3 次独立生物学重复。
• 15. 在防虫温室育苗 10–16 天（Figure 4A）：
• a. 温度 28°C–30°C；
• b. 相对湿度 60% ± 5%；
• c. 光周期 14 h 光 / 10 h 暗。
• 16. 接种前挑选 2–3 叶期、生长一致的苗；剔除生长异常、机械损伤或有可见病症的苗。
• 注：不同亚种/基因型到达 2–3 叶期所需天数不同（籼粳稻萌发与早期生长速度有别）——按叶龄与整齐度调整育苗，而不是数天数。
• 17. 每个基因型的苗放入一个夹笼（Figure 4B）。
• CRITICAL：严禁不同基因型混养同一接种笼！分笼关虫可防止飞虱优先着落某个基因型、消除虫媒选择偏倚。
• 18. 用吸虫器向每个笼接入等量带毒飞虱，平均密度 3–4 头若虫/苗。
• 19. 带毒飞虱在苗上连续取食 3 天。
• 注：期间每天轻扰虫子 2 次，促其在苗间重新分布；动作以"扰动能重分布、不伤苗、不过度致死"为度。
• 20. 接种结束后清除全部虫子。
• CRITICAL：每个接种笼虫数必须相等、苗龄必须相近——虫密度或苗龄不等会显著影响感染效率。

三、带毒与 mock 褐飞虱的制备（约 1 周）

• 21. 挑选已验证的 RGSV 阳性毒源株。
• 22. 去掉老叶、修剪茎基部，露出新鲜组织方便取食。
• 23. 将毒源株放入养虫笼（Figure 5A）。
• 24. 用吸虫器把健康的 1–2 龄若虫转到毒源株上。
• 25. 让虫子在毒源株上取食 3 天（获毒期，Figure 5B）。
• 注：若下游需要 mock 对照，取同龄健康若虫转到无毒健康苗上，同条件平行饲养。
• 26. 获毒 3 天后，把虫子从毒源株转到适合养虫的健康苗上（Figure 5C）。
• 27. 接种前在健康苗上维持约 3 天（获毒后放置期）。
• 注：放置期可按试验苗发育进度微调（苗长得慢就延长）；常规约 3 天够用。同一实验内各虫批、各处理的放置期必须一致。
• 28. 确认带毒率并计算所需虫量：
• a. 获毒结束后立即用吸虫器从每批随机抽 20–30 头。
• 注：虫子很活跃，放冰上可短暂麻痹便于操作。
• b. 单头 TRIzol 提总 RNA，合成 cDNA。
• 注：低龄若虫单头 RNA 量有限，在试剂盒推荐范围内用最大 RNA 输入量，各样本输入量尽量一致。可混样提 RNA 但估算带毒率时不可用混样。
• c. 用 RGSV-CP-F/R 引物 RT-qPCR 检测 RGSV。
• d. 扩增褐飞虱看家基因 BPH-Actin 作内参，验证 RNA 质量与逆转录成功。
• e. 每头虫至少 3 个技术重复（BPH RT-qPCR 引物效率分析见 Figure S1）。
• f. 单头判定为 RGSV 阳性：至少 2 个技术重复 Ct ≤ 35 且 BPH 看家基因可靠扩增。
• g. 带毒率 (%) = RGSV 阳性虫数 ÷ 检测总虫数 × 100。
• h. 只有带毒率 > 90% 的虫批才可用于接种；不达标须重新制备。
• CRITICAL：带毒率 <90% 的虫批禁止用于基因型比较接种。用同一同步批新孵若虫 + 已验证毒源株重做第三步；苗 2–3 叶期窗口通常容得下用新虫批接种。
• i. 按苗数计算总虫量（虫苗比 3–4 头/苗），多备补偿损耗。
• CRITICAL：设 mock 对照时，每个基因型准备两套配对苗；mock 虫与带毒虫同日程、同条件平行处理。

四、接种后病害评价（约 4 周；长期观察可选 8 周）

接种苗转入无虫条件培养，从症状、病毒 RNA（RT-qPCR）与病毒蛋白（western blot）三个层面评价感染。

• 29. 把接种苗转到无虫生长条件。
• 30. 定期巡查：逃逸虫、污染、生长异常与症状发展。
• 31. RGSV 感染评价：
• a. 接种后约 4 周，记录症状：
• i. 观察全部接种苗与 mock 对照。
• ii. 每品系拍摄代表性植株。
• iii. 对照：RGSV 接种的感病对照 HHZ vs mock HHZ，典型症状包括矮化、分蘖过多、草状丛生（Figure 6A）。
• 注：抗病材料症状可能较轻；症状观察必须与分子检测结合——不同基因型间症状严重度本身有差异。
• b. 取叶做 RT-qPCR：
• i. 接种后约 4 周，每株取新抽的系统性上位叶。
• ii. 每株独立取样。
• iii. 计算感染率时严禁把叶片混样。
• CRITICAL：感染率统计要求每次独立生物学重复每品系 ≥30 株，共 3 次独立生物学重复。
• c. RT-qPCR 检测 RGSV RNA：
• i. 每个单株样品 TRIzol 提总 RNA。
• ii. 0.5–1 μg RNA 逆转录为 cDNA。
• iii. RGSV-CP-F/R 引物检测。
• iv. 水稻 Ubiquitin 内参。
• v. 每样品 ≥3 个技术重复。
• d. 阳性株判定：
• i. ≥2 个技术重复 Ct ≤ 35 且 Ubiquitin 可靠扩增 → RGSV 阳性。
• ii. Ct > 35 或无扩增 → 阴性（前提是 Ubiquitin 成功扩增）。
• iii. 仅当植株在取样前死亡、严重受损或 Ubiquitin 扩增失败时才从统计中剔除。
• e. 计算各品系感染率：
• i. 每次生物学重复单独计算：感染率 (%) = RGSV 阳性株数 ÷ 检测总株数 × 100。
• ii. 报告 3 次重复的均值 ± SD（Figure 6B）。
• iii. 满足假设时，用单因素 ANOVA + Tukey 多重比较检验品系间差异。
• f. western blot 检测 RGSV CP 积累：
• i. 代表性植株提总蛋白。
• 注：尽量设 RGSV 阳性与 mock/健康阴性对照，确认抗 RGSV CP 抗体条带正确、阴性无杂带。
• ii. 等量总蛋白 SDS-PAGE 分离，转 PVDF 膜。
• iii. 5% 脱脂奶粉/PBS-T，20°C–25°C 封闭 1 h。
• iv. 抗 RGSV CP 一抗 + HRP 标记二抗（均用含 5% 脱脂奶粉的 PBS-T 稀释）。
• v. 每次孵育后 PBS-T 洗膜 3 次。
• vi. 化学发光显色；Actin 作内参（Figure 6C）。
• 注：基因型抗感结论应综合感染率、病毒 RNA 积累、CP 积累与症状严重度。对有发育异常的基因型（株型、黄化、矮化本身异常），症状解读要谨慎，优先看分子指标。各指标一致 → 可下"抗性增强/感病增强"结论；不一致 → 按具体受影响参数描述（如"感染频率降低但感染后病毒积累增强"），不要笼统归类。原文示例：HHZD14(D102N) 相比 HHZ 感染率更低、CP 积累更少、症状更轻，即抗性一致性增强的典型。
• g. 接种后约 8 周，可选重复表型观察与取样做长期症状评价。
• CRITICAL：接种后必须无虫培养——逃逸或污染的褐飞虱会造成二次传毒，毁掉感染率统计。

预期结果

按本流程，带毒褐飞虱可在受控条件下把 RGSV 传给感病水稻苗：

• 症状：感病株出现典型草状矮缩症状——严重矮缩、分蘖过多、叶色淡绿、生长延迟、株高下降；症状在接种后一段生长期内（视基因型、苗龄、环境与传毒效率）逐渐显现。
• 分子确认：RT-qPCR 可在感病株中清晰检出 RGSV RNA（相对健康/mock 对照）；western blot 可用 RGSV 特异抗体检出病毒 CP 积累。
• 分基因型设计的效果：阻断虫媒对不同基因型的直接偏好，提升各组感染效率的可比性；3 天接种期内每日两次轻扰重分布进一步降低取食不均，使感染结果更可重复。

局限性

• 1. 依赖虫媒传毒：结果受虫子活力、虫龄、取食行为、存活率与带毒率影响；水稻基因型本身也会反过来影响飞虱着落、取食与存活——即使标准化了接种条件，感染效率仍可能被这些因素扰动。
• 2. 分基因型策略未经系统对比：该设计旨在标准化虫媒暴露、降低基因型依赖的接种偏倚，但没有与混基因型笼接种等常规方法做定量对照，应视为提升标准化的实用手段，而非定量验证过的"消除基因型效应"方法。
• 3. 批间波动：毒源植株、虫群状态、环境参数、苗发育阶段都会造成感染效率的批间差异——生物学重复、mock 对照与分子确认不可省。
• 4. 时间是参考不是教条：各步骤时长需按本地条件（湿度、温度、光照、基因型、萌发率、苗生长速度、虫发育速度）调整；按材料状态推进，确保种子发好芽、苗到叶龄、虫到龄再进下一步。

Troubleshooting

问题 1：RGSV 感染率偏低（对应步骤 31）

解决方案：

• RT-qPCR 信号弱或不稳定 → 检查 RNA 质量与内参扩增；避免用严重衰老或坏死组织；怀疑 PCR 抑制时稀释 RNA/cDNA 模板。
• 获毒前确认毒源株感染；只用病毒积累充分的阳性株，弃用弱信号、严重衰老或疑似混合感染的毒源（对应步骤 21）。
• 只用带毒率 >90% 的虫批（对应步骤 28）。
• 感染效率持续偏低时，适度延长获毒期（步骤 25）和/或接种期（步骤 19），但同一实验内各处理时长必须一致。
• 不要用处于生物/非生物胁迫下的苗——胁迫苗会改变飞虱取食行为、降低感染效率（对应步骤 16、27）。
• 用同步的 1–2 龄若虫获毒与接种，不要混用不同发育批次的虫——虫龄、龄期或性别组成差异会加大传毒波动。

问题 2：获毒/放置/接种期褐飞虱死亡率高（对应步骤 19、25、27）

解决方案：

• 用新鲜、健康、适合喂虫的苗。
• 获毒、放置与接种全程保持稳定的温度、湿度与光周期。
• 取食期间勤查笼与腔室。
• 飞虱取食会分泌蜜露，高湿不通风时易滋生真菌/细菌——苗、滤纸、笼或腔室表面长霉，立即换苗并清洁/更换污染物品。
• 保证腔室通风良好、不积湿。
• 多备虫，补偿转移损耗与死亡。

问题 3：飞虱偏好造成基因型偏倚

混基因型或不分笼的接种体系中，带毒飞虱会直接在不同基因型苗之间做选择；各基因型对飞虱着落、取食、存活的影响不同，会实质性带偏抗感评价。建议接种前先评估基因型对飞虱行为的影响，或直接采用分基因型接种。

解决方案：

• 严禁不同基因型同笼：一笼一基因型/一处理（对应步骤 17）。
• 各笼苗数、虫苗比、虫龄、接种时长完全一致。
• 接种期每天轻扰虫子 2 次，促笼内重分布（对应步骤 19）。
• 有条件时，接种前先评估目标基因型上飞虱的着落/取食/存活——尤其对疑似强烈影响飞虱行为的材料。

问题 4：mock 或健康对照株意外检出 RGSV（对应步骤 31）

解决方案：

• 健康虫、mock 虫、带毒虫、RGSV 毒源株、已接种苗分区（各自防虫区域）饲养。
• mock 与 RGSV 处理尽量用分开的吸虫器、笼、腔室与操作工具。
• 处理过带毒虫或毒源株后，清洁或更换工具。
• 接种后无虫条件下维持接种苗。

参考信息

• Lead contact：Jianguo Wu（wujianguo81@126.com）
• Technical contact：Ming Wu（fafu.edu.cn）
• 材料可获性：本研究未产生新的独特试剂。
• 数据与代码：本研究未产生新数据或代码。
• 利益声明：Wu、Yang、Zhao、Zhang 与 Wu 是 D14 编辑水稻材料与 RGSV 抗性相关中国专利申请（202610063929.1）的发明人（福建农林大学）。
• 资助：国家重点研发计划（2023YFF1000500）；农林生物安全全国重点实验室联合研究项目（SKLJRP2504）。

本文为 STAR Protocols 开放获取文章的中文解读（第 019 期），仅供学习交流，原文以 Cell Press 出版版本为准。