鱼类性腺成熟度分期：以组织学锚定的宏观判别标准化流程

原文：Protocol for histology-anchored macroscopic staging of gonadal maturity in exploited fishes

作者：Régis Santos, Mariana Cruz, Wendell Medeiros-Leal, Maria Domitilia Rosa, Ângela Canha, Andreia Braga-Henriques, Ualerson Peixoto（葡萄牙亚速尔大学 OKEANOS 海洋研究所等）

发表：STAR Protocols, 2026-08-27｜DOI: 10.1016/j.xpro.2026.104812｜PMC13544389

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摘要

本方案提供一套以组织学为基准锚定的鱼类性腺成熟度分期工作流程，适用于商业开发鱼类的常规渔业监测。内容包括：野外元数据记录、性腺拍照、中央部位组织取材固定、石蜡切片制作、苏木精–伊红（H&E）染色、配子发生特征镜检诊断，以及依托统一"繁殖阶段"框架、结合物种与性别特异性参照描述完成最终分期。

需要强调的是：本方案标准化的是记录方式与判定逻辑，而非提出一套新的成熟度分期量表。配套的 13 个物种宏观–组织学对照参考图集已存入 Mendeley Data（https://doi.org/10.17632/fctjgb8wz2.2 ），应用前务必先查阅。

本方案的开发基于亚速尔群岛常规渔业监测中的 13 个商业鱼种：黑腹无齿鲷（Pagellus bogaraveo）、蓝圆竹荚鱼（Trachurus picturatus）、鲉状石狗公（Helicolenus dactylopterus）、真鲷（Pagrus pagrus）、康吉鳗（Conger conger）、紫红鲷（Beryx decadactylus）、新西兰鲷（Beryx splendens）、鹦嘴鱼（Sparisoma cretense）、带鱼（Lepidopus caudatus）、科利鲭（Scomber colias）、灰鳕（Mora moro）、黑鲔带鱼（Aphanopus carbo）与钝背鳐（Raja clavata）。扩展到其他类群时，须先核实目标物种的宏观判据与组织学诊断特征是否匹配其繁殖生物学。

创新点

常规渔业成熟度分期多依赖取样时的宏观判别，组织学检查仅用于部分个体、专项研究或判据验证。这导致野外分类、组织处理、镜检诊断与参考图像往往分散管理，可追溯性、观察者校准与跨项目可重复性都受限。本方案把宏观分期与组织学验证整合为单一分步工作流——每尾鱼从解剖到最终"组织学锚定分期"全程可追踪；同时显式区分"通用流程步骤"与"物种/性别特异性野外判据"，使国际通行的繁殖阶段术语得以一致应用，又保留常规渔业取样所需的物种化描述。

核心推进点：野外分期 + 组织学基准比对 + 图像校准 + 质控文档四件事并入一个可复现的流程。

化学安全与野外限制

耗时：实验或野外出发前 10–20 分钟。

1. 处理 Bouin 液、盐酸、乙醇、透明剂、苏木精、伊红与封片剂之前，先了解本机构的化学品安全规定。
2. 接触固定液、酸、透明剂、染液与封片剂时，佩戴丁腈手套、实验服与护目镜。
3. 尽量在认证通风橱内操作上述试剂。
4. 出海前确认 Bouin 液能否在船上运输和使用；若船、机构或国家规定不允许船上固定，则在获批的取样条件下把性腺或子样本运回实验室。
5. 不能船上固定时，靠港后尽快解剖、拍照、取材。
6. 无法立即固定时，将完整性腺或子样本 0–4°C 冷藏保存，防止干燥。
7. 未固定样本放入洁净、标签完好的容器或密封袋；避免性腺组织直接接触融冰、海水或其他液体。
8. 有条件时记录从捕捞、解剖、取材到固定之间各环节的间隔时间。
9. 除非别无选择，不要冷冻拟做组织学校准的性腺。若处理了冻融样本，须在元数据中记录，并谨慎解读其宏观颜色、组织质地与组织学保存状态。
10. Bouin 液废液、乙醇废液、透明剂废液、染色废液与封片废液分别收集进贴标的危险废物容器。

CRITICAL：Bouin 液含苦味酸，须遵守机构的储存、搬运、运输、废弃物与泄漏应急规定，切勿让 Bouin 液或苦味酸残留干涸。固定延迟会导致自溶、组织结构丢失、性腺颜色改变以及诊断性细胞结构保存不良。不要用保存不良的组织制作参考图像或校准宏观判据。

机构许可

本方案的生物材料来自商业渔获，未对活体脊椎动物进行实验操作。使用者须确认本流程符合所在机构、地区、国家及国际的相关要求；涉及保护物种、实验动物、非商业样本或常规渔业监测之外的采样时，可能需要额外授权。

定义取样单元与元数据结构

耗时：野外取样前 1–2 小时。

1. 解剖前为每尾鱼分配唯一编号。
2. 准备元数据表，记录：物种、采样位置、日期、样本来源（商业渔获/调查船/市场采购/养殖场等）、全长、叉长（如适用）、总重、去脏重、肝重、性腺重、性别、暂定宏观分期、图像编号、组织盒编号、切片编号、最终组织学锚定分期。
3. 取样开始前统一"繁殖阶段"术语。本方案采用国际公认的阶段词汇，区分：未成熟（immature）、发育中（developing）、具备产卵能力（spawning capable）、正在产卵（actively spawning）、退化中（regressing）、再生中（regenerating）。

CRITICAL：野外记录、照片、组织盒、蜡块、切片、数据集必须使用同一尾鱼编号。编号链条一旦断裂，宏观观察与组织学诊断就无法对应。

区分通用、物种特异与可选要素

耗时：首次应用于新物种前 30–60 分钟。

1. 给新物种分期前先研读表 1。
2. 通用要素应用于所有个体。
3. 物种与性别特异性描述仅作操作性野外线索；须在校准与验证阶段用组织学确认。
4. GSI（性腺体指数）只是性腺投入量的可选定量描述，不得作为分期诊断判据，也不得用于推翻宏观或组织学证据。

表 1｜通用流程组件与物种特异性参照要素

准备参考材料与图像文件

耗时：文件结构搭建约 1–2 小时。

1. 建立文件夹：宏观原图、宏观处理图、镜检原图、镜检标注图、元数据表、最终参考图。
2. 已校准物种出发前，准备好物种与性别特异的成熟度参考卡片。
3. 新物种取样前，先收集初次成熟体长估算、繁殖季节性、产卵期与繁殖模式的现有资料：

a. 据此划定预期未成熟与成熟体长范围； b. 取样计划覆盖初次成熟体长上下两侧的个体； c. 可行时在预期产卵期之前、期间与之后取样，覆盖发育中、具备产卵能力、正在产卵、退化中与再生中各状态； d. 若估算数据来自不同种群、地理区域或采样时段，按临时性资料对待。

1. 新物种先安排组织学校准阶段，再依赖宏观分期做常规野外判定。

暂停点：元数据模板与文件夹结构可归档后跨航次复用。把既有取样计划用于不同种群、区域或年份前，重新核对初次成熟体长与产卵期。

关键资源表

材料与设备

关键资源表中的设备可用同等仪器替代，前提是固定质量、切片厚度、染色对比度与图像分辨率足以诊断物种参考材料中列出的细胞特征。

Bouin 固定、组织厚度、石蜡完全浸透、5–8 μm 切片厚度、H&E 染色对比度与图像分辨率，是复现本方案诊断性组织学判据的关键。若改用其他固定液，须先与 Bouin 固定的参考材料做本地验证。

• 尽量使用新鲜 Bouin 液做诊断性固定。参考图像材料、校准样本与最终分期样本不建议复用 Bouin 液：组织液与前次样本会稀释或改变固定液有效成分，导致固定不完全或不均匀、组织变脆、染色弱或不稳定、配子发生结构保存差、个体间可比性下降。若不得不复用，须本地验证固定质量并记录复用条件，受损材料不得用于参考图像或读片校准。
• Bouin 固定后 70% 乙醇洗液仍明显发黄时应更换。透明剂、苏木精、伊红与封片剂可按本实验室质控规则复用，效率或对比度下降时更换。
• Bouin 液含苦味酸，按机构安全规定处理。
• 同一校准系列内保持固定时间、组织大小与取材区域一致，减少处理伪差。
• 诊断切片厚度 5–8 μm。
• 除非物种解剖学要求并已记录替代方案，一律取性腺中央区横切面。

试剂配方

70% 乙醇：向约 200 mL 蒸馏水中加入 729 mL 96% 乙醇，混匀后定容至 1 L。18–25°C 密封、化学相容容器避污染保存，最长 6 个月。

1% v/v 盐酸分化液：向约 800 mL 蒸馏水中缓慢加入 10 mL 盐酸原液，小心混匀后定容至 1 L。

CRITICAL：将酸加入水中，不可反向。在认证通风橱内配制，佩戴手套、护目镜与实验服。

试剂与溶液储存

分步实验方案

一、采集生物学测量并赋予暂定宏观分期

耗时：解剖后每尾约 5–10 分钟。

1. 记录样本状态：捕后立即解剖、靠港后取样、冷藏、冷冻或解冻；有条件时记录捕捞—解剖—取材—固定各环节间隔时间。
2. 记录个体编号、物种、采样位置、日期与样本来源；核对野外记录表、样本标签、图像文件名与解剖产出的样本容器使用同一编号。
3. 测量全长与叉长（如适用）。
4. 记录总重、去脏重、肝重（需 HSI 等条件指数时）与性腺重。

注意：HSI 只是肝脏投入或能量状况的可选描述，不用于分期判定。

1. 监测项目要求年龄鉴定时，采集耳石、鳞片等获批年龄结构。
2. 解剖时暴露性腺，避免损伤性腺壁。
3. 按物种特异类别宏观判定性别：雄、雌、雄相雌雄同体、雌相雌雄同体、雄性主导的同时性雌雄同体或雌性主导的同时性雌雄同体（如适用）。
4. 用统一繁殖阶段术语与相应物种/性别特异性参照描述，赋予暂定宏观成熟度分期。（→ Troubleshooting 6）

CRITICAL：凡物种、性别或成熟期未经组织学校准，野外分期一律视为暂定。

二、性腺拍照与取组织学子样本

耗时：每尾 10–20 分钟。

1. 性腺放在洁净、哑光、中性背景上，旁边放刻度尺：

a. 可用白色、浅灰、哑光蓝或黑色背景； b. 选择与性腺对比度最高的背景； c. 避免反光、带花纹、潮湿、带血或强彩色背景（会改变性腺表观颜色或降低对比度）。

1. 同种同性的个体保持一致摆拍方向。
2. 拍摄高分辨率宏观图像，个体编号出现在画面内或文件名中：

a. 取材前核对图像文件名、样本标签与野外记录表编号一致； b. 用洁净哑光中性背景； c. 刻度尺与性腺同平面； d. 保留未标注原图； e. 参考图像导出为 TIFF 或高质量 JPEG，≥300 dpi。

1. 两侧性腺形态对称、宏观分期一致时，从一侧性腺叶中央区切取组织块（图 1）：

a. 组织厚度 3–5 mm； b. 性腺大、不均匀、不对称或外观不同时，每叶各取一份标注子样本； c. 每份子样本的取样位置写入个体元数据。

1. 性腺叶在中央区融合时，避免切开融合区损伤性腺壁或破坏组织方向；从每叶最近的完整中央区取样，并在元数据中记录替代取样位置。（→ Troubleshooting 9）
2. 每块组织立即放入标注组织盒或固定瓶：

a. 用耐溶剂石墨铅笔、组织学级永久墨水或经验证的耐溶剂聚酯标签； b. 禁用未处理纸质标签或水溶性墨水； c. 固定前核对组织盒/瓶编号与个体编号、野外记录表、宏观图像文件名一致； d. 同一尾鱼取多份子样本时，个体编号后加叶位/子样本后缀。

1. 再次核对组织盒/瓶编号与个体编号一致。

CRITICAL：避免组织块过厚。厚的性腺组织固定慢，固定不完全的风险升高。（→ Troubleshooting 1）

图 1｜性腺组织取样与方向：(A) 从性腺中央区取代表性组织段；(B) 修整至最大厚度 5 mm；(C) 切面朝向一致放入标注组织盒；(D) 石蜡包埋后切片机切 5–8 μm 切片。

三、固定性腺组织并去除苦味酸残留

耗时：约 5 天（48 h 固定 + 约 72 h 乙醇洗涤）。

1. 每块性腺子样本立即浸入 Bouin 液，固定约 48 h，固定液与组织总体积比 ≥10:1：

a. 多个样本同容器固定时，各组织块保持在自己标注的组织盒内； b. 所有组织盒完全浸没、四周有固定液自由流通； c. 按容器内组织总体积计算固定液用量； d. 不得过载装填。

1. 固定的 48 h 内，密封容器置于获批通风化学品储存柜，18–25°C。
2. 固定结束后，转入足量 70% 乙醇，完全浸没组织或组织盒。
3. 密封容器置于获批易燃液体储存柜，18–25°C，直至组织处理。
4. 70% 乙醇中保持约 72 h。
5. 洗涤期间乙醇仍明显发黄则更换。（→ Troubleshooting 2）
6. 除非本地针对目标组织与染色流程验证过，否则不做额外化学中和。

CRITICAL：进入常规组织处理前，须通过延长乙醇洗涤去除苦味酸残留。去除不彻底会损害染色并使组织变脆。

暂停点：尽可能按指定时间完成 Bouin 固定。约 48 h 后转入 70% 乙醇，以去除苦味酸残留，并降低过度固定、组织变脆与染色不均的风险。

四、处理、包埋、切片与染色

耗时：2–3 天。

1. 将固定并乙醇洗涤后的样本装入自动组织处理机：

a. 试剂体积足够，全程浸没所有组织盒； b. 试剂循环不受阻； c. 不超过仪器已验证的组织盒容量； d. 3–5 mm 厚的性腺子样本按步骤 24–26 的脱水、透明、浸蜡程序处理。

1. 脱水：70% 乙醇 60 min → 80% 乙醇 60 min → 90% 乙醇 60 min → 95% 乙醇 60 min → 100% 乙醇两缸各 90 min。
2. 透明：SafeSolv Q Path 二甲苯替代品两缸各 90 min；大块或富脂性腺按已验证程序增加第三缸 90 min。
3. 浸蜡：熔融组织学级石蜡三缸各 90 min，石蜡保持 58–60°C（或不超过制造商熔点以上 2°C）。
4. 处理机取出组织盒，开盒前核对盒上编号完整清晰。
5. 包埋模先注入部分熔融石蜡。
6. 组织从盒转入模具，摆放成横切面方向（图 1）；可用金属底模、硅胶模、盒底模或同等包埋系统。
7. 组织盒主体、盒盖或等效耐溶剂耐热标签全程与蜡块绑定；脱模前核对编号仍可辨认。
8. 补满石蜡，组织完全覆盖并形成稳定块面。
9. 蜡块 18–25°C 开始凝固，再移至冷台完成硬化。
10. 轮转切片机上先粗修约 30 μm，至组织面暴露。
11. 切诊断连续切片 5–8 μm。体视学或其他定量图像分析可切更薄（如 3 μm），按测量目标、组织类型与实验室流程验证。（→ Troubleshooting 3）
12. 展片水浴温度约低于石蜡熔点 5–10°C（熔点 56–58°C 的石蜡常用 40–45°C），展平切片、去皱。

CRITICAL：每张切片在水面不超过 5 分钟。过度展片会导致组织过度膨胀、结构丢失或切片变脆。（→ Troubleshooting 4）

1. 捞片到洁净载玻片：

a. 每张标注个体编号与切片编号； b. 加物种、组织侧/叶、切片层面、日期或批次号（如适用）； c. 烘干前核对切片编号与组织盒、蜡块编号一致。

1. 恒温烘片机 35–40°C 干燥 12–24 h。
2. 烘干后肉眼并必要时低倍镜检查：

a. 切片贴附、展开； b. 诊断区域存在（解释需要时含性腺壁）； c. 有褶皱、脱片、组织丢失或缺诊断区时，染色前重切。（→ Troubleshooting 3、4）

1. 脱蜡前立即 60°C 烘烤 30–35 min，熔去残余石蜡。
2. 脱蜡、水化、染色、脱水与透明用 Wheaton® 20 片染色缸手工完成：

a. 每缸最多 20 片，加 250 mL 试剂； b. 全程组织完全浸没； c. 缸间不得让切片干燥。

1. 脱蜡：SafeSolv 两缸各 5 min。
2. 水化：100% 乙醇两缸各 2 min → 95% 2 min → 80% 2 min → 70% 2 min → 蒸馏水 2 min。
3. 苏木精染色约 15 min。
4. 1% 盐酸分化：蘸洗载片架，每次蘸洗后镜检核与背景着色。分化至背景变浅而核细节仍清晰；避免过度分化降低核对比度；自来水冲洗约 5 min。
5. 伊红复染约 5 min。
6. 脱水：70% 乙醇 1–2 min → 80% 1–2 min → 95% 1–2 min → 100% 两缸各 2 min。
7. 透明：SafeSolv 两缸各 5 min。
8. 封片剂 + 盖玻片封片。（→ Troubleshooting 4、5）

CRITICAL：同一参考系列内保持切片厚度与染色条件一致——厚度与着色强度差异会改变表观细胞细节。开盒取组织前、蜡块凝固后各核对一次个体编号。包埋是样本身份丢失的高风险环节。

五、采集组织学图像并诊断性腺特征

耗时：每片 15–30 分钟，视组织复杂度而定。

（本方案使用 Leica CTR6000 复式显微镜 + LAS Core / LAS X 软件采图。）

1. 每片至少拍一张低倍全景图：包含组织方向、性腺壁、基质组织、腔/片层结构（如存在）与配子发生组织分布；视野覆盖整张切片或代表性区域。
2. 高倍拍摄诊断性细胞结构：

a. 卵巢：最晚期卵母细胞阶段，以及（存在时）水合卵母细胞、产卵后滤泡、闭锁； b. 精巢：生精囊、小叶腔、精子，以及（存在时）输精管或精液结构。

1. 显微图像存 TIFF 或其他无损格式归档：原图与标注图分开保存；所有导出图带比例尺；记录放大倍数、物镜、显微镜、相机、软件版本、图像格式与分辨率。
2. 打开文档 S1 的组织学评分模板，每尾鱼建一条记录。
3. 记录个体编号、切片编号、物种、性别、读片人、读片日期、样本状态、组织保存质量、切片方向、切片质量与查看的诊断视野数。
4. 卵巢记录最晚期卵母细胞阶段，以及（存在时）卵原细胞、初级生长卵母细胞、皮层泡卵母细胞、早/中/晚卵黄卵母细胞、水合卵母细胞、产卵后滤泡与闭锁。
5. 精巢在结构化评分表记录生精原细胞、精母细胞、精子细胞、精子的存在/主导特征/分布，以及小叶腔扩张与输精管或精液结构状态。
6. 软骨鱼类（板鳃类）按类群适用的组织学判据记录性别特异滤泡或生精特征。
7. 每个诊断结构标记为存在/缺失/不确定/无法评估；记录最晚期生殖细胞阶段、产后指标、诊断置信度、不确定原因、所需行动与最终组织学阶段。（→ Troubleshooting 7）
8. 对代表性显微照片做标注，标出用于分期判定的诊断结构：

a. 以已存档图集的标注样例为参照； b. 在原图副本上标注，不动归档原图； c. 标注图与原图分开存放。

1. 固定不良、组织破碎、褶皱过多或染色过弱的切片，标记重切或重染。（→ Troubleshooting 1、3、4、5）

注意：体视显微镜采的低倍图可为彩色；单色相机采的高倍图可为灰度。

六、读片人校准与一致性记录

耗时：每次校准 1–3 小时。

1. 选分层校准集：条件允许时每性别×每成熟期至少 10 尾；含代表性与诊断困难病例；剔除因严重固定、切片或染色伪差而不可评估的切片；档案超出所需数量时在各"性别×阶段"层内随机抽取；少于 10 尾的阶段在文档中说明。
2. 给每位读片人提供统一繁殖阶段词汇、物种/性别描述与图集中对应参考图像。
3. 读片人独立判定组织学成熟阶段：屏蔽暂定宏观分期、体长、体重、性腺重、GSI 与先前读片结果；只提供物种、解释所需的性别、编码切片编号与相应细胞词汇/图集；编码编号与完整元数据的对应关系保存在单独的权限受限文件中。
4. 每次独立诊断录入结构化评分模板。
5. 用一致率百分比评估读片人间一致性；样本量允许时，两人用 Cohen's kappa，多人用 Fleiss' kappa。
6. 分歧案例共同复核，判断源于组织质量差、过渡阶段模糊、术语差异还是参考材料不足。
7. 引入新物种、性别、繁殖阶段、读片人或成像配置时重新校准。

CRITICAL：物种或成熟期未经组织学验证时，不得以未校准的宏观分期作为最终分期的唯一依据。

七、宏观与组织学证据核对，赋予最终分期

耗时：采图后每尾 10–20 分钟。

（组织学核对是必需步骤：宏观分期可能错判成熟状态——未成熟、发育中、退化中与再生中的外观重叠尤其常见。）

1. 比对暂定宏观分期与结构化评分表中的组织学诊断。
2. 最终分期前复核不一致的个案：

a. 检查个体记录、宏观图像、取样位置、切片质量、切片方向与诊断结构； b. 判断不一致源于组织保存差、性腺发育不均匀、过渡阶段模糊、宏观误读还是组织学证据不足。

1. 持续分歧通过独立复读或共识评审解决：

a. 复核后仍分歧，请第二位已校准读片人独立复读； b. 复读仍不能解决则共识评审； c. 不得强行让组织学诊断迁就暂定宏观分期； d. 保存差、诊断结构冲突或置信度低的个体在最终数据集中打标。

1. 以组织学诊断为主要证据、宏观记录为辅助信息，赋予最终组织学锚定分期。
2. 记录宏观与组织学判定是否一致。
3. 不一致时记录原因：组织保存差、性腺发育不均、过渡阶段模糊、宏观误读、组织学证据不足，或未成熟/发育中/退化中/再生中的外观重叠。（→ Troubleshooting 6）
4. 不得用 GSI 推翻宏观或组织学证据。
5. 组织保存、元数据缺失、编号不一致或低置信度组织学诊断无法可靠判定时，将该个体标记为不适合最终分期。

八、整理参考图像并归档流程产出

耗时：分期后每物种 1–4 小时。

1. 为每个可用的物种、性别、成熟阶段选代表性宏观与组织学图像。
2. 所有显微图像必须带比例尺。
3. 跨物种统一使用图集定义的缩写标注诊断细胞结构。
4. 原图与编辑、裁剪、标注或压缩版本分开保存。保留原图支持未来再分析、体视学测量、自动图像分析、与后续采样对比及分期判定独立核验。
5. 归档个体级最终数据集：个体编号、物种、性别、宏观分期、组织学诊断、最终分期、GSI（如计算）、样本状态、图像文件名与图像引用。
6. 在机构、伦理与数据治理政策允许时，把图像档案、个体级数据集与阶段参考材料存入版本控制仓库、机构数据档案或稳定的公共仓库。

CRITICAL：原图、标注图、组织学诊断与最终分期必须通过同一尾鱼编号保持关联。关联丢失就无法独立核验分期结果。（→ Troubleshooting 8）

预期结果

本方案为每尾鱼产出可追溯的分期记录：野外元数据、宏观性腺图像、固定处理后的组织学材料、诊断显微图像与最终组织学锚定分期。产出不是新的分期量表，而是一套把个体归入公认繁殖阶段、同时保留物种/性别特异性诊断描述的标准化流程。

成功应用的标准：H&E 染色性腺切片上关键卵发生或精子发生特征可判读。雌性可见初级生长、皮层泡、卵黄卵母细胞、水合卵母细胞、产卵后滤泡与闭锁（如存在）；雄性可见生精原细胞、精母细胞、精子细胞、精子、小叶组织、腔扩张与输精管状态。13 个源物种的预期宏观与组织学结果见图集。

方案同时产出质控记录：宏观–组织学一致与不一致的判定。监测项目可用这些记录训练观察者、审计野外分期、更新物种参考材料，并在有重复观察时计算一致性指标。

定量与统计分析

• GSI = 100 × 性腺重 / 总重（或去脏重），按监测项目惯例选定分母并在分析前统一声明。GSI 仅作性腺相对投入或季节繁殖状态的补充描述，不作为分期诊断判据。
• HSI = 100 × 肝重 / 去脏重（或按项目惯例）。与 GSI 一样，HSI 是可选描述，不用于分期。
• 评估实施质量时，用总体一致率、分期特异一致率、混淆矩阵，以及 Cohen's kappa（阶段结构有序时可用加权替代）汇总宏观–组织学一致性。编号不一致、分期前性腺受损、组织保存无法诊断或物种阶段缺参考材料的个体剔除出一致性计算，并明确报告剔除原因。

局限性

• 方案针对捕后/靠港后尽快取样的新鲜或冷藏样本优化。延迟取样、冷冻、解冻与长时间储存会改变性腺颜色、膨润度、质地与细胞保存，降低宏观分期与组织学诊断可靠性；这些状态必须写入元数据。冻融材料在无替代时可处理，但分期结果应谨慎解读，且保存不足时不得用于校准宏观描述。
• 方案标准化的是流程与判定逻辑，不是跨类群的性腺外观。宏观描述因中上层/底层/真骨鱼/软骨鱼/雌雄同体物种的形态差异而保持物种与性别特异。未经组织学校准，不得把宏观线索从一个类群搬到另一个类群。
• 源材料的时间跨度提高了各繁殖阶段的代表性，但本身不能证明诊断描述的时间不变性。年际环境波动、种群结构、采样季节与渔业选择性都可能影响各阶段出现频率；阶段宏观描述的时间稳定性需另行分析。
• 方案依赖取样组织中可见的结构与配子发生特征，无法捕捉不在性腺留下结构印记的短期内分泌或生理变化。快速过渡状态若采样未落在对应结构可检出的短繁殖窗口内，会被错过。
• 现有材料并非每个物种与性别都覆盖了所有成熟阶段——缺口源于可获样本的阶段构成、取样时机与保存质量。缺失阶段不用非代表性图像顶替；图集可在未来获得更多经组织学验证的样本时扩充。
• 源材料未生成正式的读片人间/读片人内一致性估计。因此修订版方案把读片人校准、结构化评分、可行时独立读片、一致性评估与分歧解决列为质控步骤。实施监测项目应在培训与质保期间量化一致性——尤其应用于新物种、新成熟期、新读片组或新成像配置时。

Troubleshooting

问题 1｜组织中心固定不良（相关步骤 12、14、16–21）

• 取材时减小组织厚度、提高固定液/组织体积比、确保立即浸入 Bouin 液；可从同一性腺重新取材；部分自溶或固定不完全的组织不得用于最终分期。

问题 2｜Bouin 固定后切片残留黄色或染色不均（相关步骤 16–22、41–48）

• 无损评估苦味酸残留：组织浸入 70% 乙醇 24 h 后看洗液颜色；至少每 24 h 更换一次 70% 乙醇，直至整段 24 h 洗涤后乙醇仍清亮至淡黄。更换后乙醇呈深黄或橙色时不得进入脱水。未经组织与染色流程验证，不引入化学中和步骤。

问题 3｜石蜡切片碎裂、压缩或脱片（相关步骤 23–39）

• 核实石蜡浸透、切片前降低蜡块温度、调整刀角、控制在 5–8 μm、用洁净载片并充分干燥；接触载片、水浴与切片材料时避免护手霜或油污；怀疑污染时换水浴水；脆弱或贴附差的切片用正电荷载片；方向或浸透差则重新包埋；碎裂妨碍诊断时重切蜡块。

问题 4｜切片褶皱或组织重叠（相关步骤 35–38）

• 调整水浴温度，让切片自然展平但展片不超过 5 min；避免切片在水面积压；仍有褶皱或重叠则烘干前重捞。染色前肉眼及低倍镜检查；褶皱、脱片、组织丢失或缺性腺壁影响诊断时染色前重切。

问题 5｜H&E 对比度弱或过强（相关步骤 41–48）

• 检查染液新旧、苏木精时间、分化终点、水洗时间、伊红时间、脱水顺序与透明质量；有复片时重染；参考图像用样本的染色时间保持一致。

问题 6｜宏观与组织学判定不一致（相关步骤 8、67–74）

• 核对样本身份、取样位置、样本状态、组织保存、切片方向、染色质量与评分表记录的诊断结构；确认不一致是否涉及已知模糊过渡（未成熟 vs 再生、发育早 vs 发育晚、具备产卵能力 vs 正在产卵、退化中 vs 再生中）；可行时独立复读并比较已校准读片人判定；仍分歧则共识评审并记录不确定原因；以组织学为诊断基准，但保存差、结构冲突或低置信度个案打标而非强判定；只有多个保存良好、组织学验证一致的样本显示同一偏差时才更新物种宏观描述；新物种/新阶段/新读片组/新成像配置常规应用前先量化一致性；不得为迁就宏观分期而修改组织学诊断。

问题 7｜未成熟与再生中性腺难以区分（相关步骤 54–57、67–74）

• 综合检查基质组织、性腺壁厚度、残留配子、闭锁与既往产卵证据；用完整组织学背景而非单一细胞特征判别；保存质量、取样时机或组织方向妨碍可靠区分时标记为"不确定"。

问题 8｜图像、蜡块、组织盒或切片编号对不上，无法审计最终分期（相关步骤 1–2、11、14–15、27、30、36、51–53、58、79–80）

• 编号链条无法重建时，将个体剔除出最终验证与一致性分析；在解剖、贴盒、包埋、贴片、图像命名与数据录入各环节强化编号核对；原图、标注图、组织学诊断与最终分期记录全程使用同一编号。

问题 9｜性腺叶融合、不对称或不均匀（相关步骤 12–14）

• 强行分离会损伤性腺壁或破坏组织方向时不要分；两叶宏观不同时，各叶完整区分别取标注子样本；取样位置写入元数据；最终分期用保存最好、最具代表性的切片，不均匀个体打标复核。

资源可用性

• 通讯/技术联系人：Régis Santos（regis.vs.santos@uac.pt）
• 材料：本方案不产生新试剂或生物材料；切片、蜡块与图像文件由作者持有，合理请求且符合机构政策与样本保存约束时可能提供。
• 数据与代码：无自定义代码。物种与性别特异宏观–组织学参考图集存于 Mendeley Data（https://doi.org/10.17632/fctjgb8wz2.1 ）；结构化组织学评分模板随文提供（表 S1）。

致谢与资助

作者感谢亚速尔群岛欧盟数据收集框架下参与渔业数据采集的所有人员；感谢 Morgan Casal-Ribeiro 与 Osman Crespo-Neto 协助采样。本工作在 AZORMAT、FISHSTAZ 与 Fish4MSY 项目内完成：AZORMAT 与 FISHSTAZ 由亚速尔自治区政府资助，Fish4MSY（ref. MAR-016.9.1-FEAMPA-10018）由欧洲海洋、渔业和水产养殖基金（EMFAF）通过亚速尔自治区政府 MAR2030 运营计划资助；并获 FCT（UID/05634/2025、UID/PRR/05634/2025）、区域科学创新与发展厅 PROSCIENTIA 计划（M1.1.A/FUNC.UI&D/014/2025）以及 FCT 博士奖学金（UI/BD/153596/2022）支持。作者声明无利益冲突。