4 组髓母细胞瘤 MBT375 患者来源肿瘤细胞的短期体外培养

摘要

稳定持久的体外培养一直是 4 组髓母细胞瘤（Group 4 medulloblastoma, G4-MB）新疗法临床前开发的迫切未满足需求。本方案介绍 G4-MB 肿瘤细胞的建立与短期体外培养方法，涵盖脑肿瘤细胞分离、小鼠颅内原位移植、体外培养与实验铺板。该体系可支持短期体外传代与药物筛选；若要长期扩增这些 G4-MB 模型，则必须依赖小鼠体内连续移植（serial engraftment）。

关键词领域：细胞生物学、细胞培养、肿瘤、模式生物。

亮点

• 详细指导如何分离并维持 4 组髓母细胞瘤细胞。
• 指导如何在体外维持健康稳定的细胞群体。
• 从患者肿瘤到功能实验的高效使用工作流。

背景

G4-MB 患者来源肿瘤细胞以「极难体外维持」著称。体外模型的缺乏严重限制了 G4-MB 研究的临床前推进。为解决这一瓶颈，作者建立了患者来源 G4-MB 肿瘤的分离与培养方法，成功获得两株可短期培养的体外细胞系 MBT375 与 MBT417。本方案以 MBT375 为例演示。

MBT375 肿瘤表型：先认清两类细胞

G4-MB 体外扩增的主要限制因素是增殖能力低。使用多聚鸟氨酸 + 层粘连蛋白（Poly-L-Ornithine + Laminin, POL）包被是缓解该限制的关键策略。POL 包被板上会出现两种表型截然不同的细胞群：

• MBT375 肿瘤细胞：胞体小而圆润光滑，悬浮状态下呈明亮小点；贴壁时胞体小而亮，从胞体伸出 2–3 条纤细突起。
• MBT375 滋养细胞（feeder cells）：胞体大而伸长，贴壁生长，为肿瘤细胞球提供支持性微环境，显著提升体外存活时长。

肿瘤细胞球既有锚定在滋养层单层上的，也有悬浮的；两者在 POL 上以局部整合位点共存——这些正是球体锚定与新球体形成的位置。

重要提示：处于应激状态的 MBT375 肿瘤细胞（传代后、复苏后或从小鼠脑分离后）呈现边缘粗糙、不对称的碎片样表型，极易被误判为死细胞或碎片。由于 G4-MB 培养物增殖能力低，小鼠颅内连续移植仍是长期大量扩增的主要手段。

本方案分四大板块：(1) 从新鲜切除的患者肿瘤中分离 G4-MB 细胞；(2) MBT375 颅内移植入小鼠实现大量扩增；(3) 终点时从小鼠脑分离肿瘤细胞；(4) MBT375 体外培养——含传代、分板、铺板，以及从患者肿瘤到功能实验的最优工作流。

创新点

目前永生化 G4-MB 体外细胞系数量有限，且普遍缺乏瘤内异质性、常出现遗传/表型漂移，其亚组归属在文献中也存争议；耐用的患者来源体外 G4-MB 模型此前并不存在。合适的临床前与发现模型的缺失，是 G4-MB 更好疗法开发的主要瓶颈。本模型的重要创新在于绕开了当前 G4-MB 体外培养特性的限制，使患者来源 G4-MB 肿瘤细胞的短期体外培养成为可能。

机构许可（如适用）

人源 G4-MB 切除肿瘤经麦克马斯特大学外科学系获取，所有患者均于肿瘤细胞分离前取得知情同意；全部体内实验均按麦克马斯特大学动物研究伦理委员会（AREB）批准的方案进行。执行本方案者必须获得所在机构相关主管部门的许可并遵守其规定。

准备工作一：NeuroCult 完全培养基（NCC）配制

耗时：约 10 分钟

1. 配制 500 mL NCC 培养基：在 NeuroCult NS-A 基础培养基（人源）中加入 NeuroCult NS-A 增殖补充剂（50 mL）、0.2% 肝素溶液 500 μL、1% 抗生素-抗真菌溶液、表皮生长因子 EGF（终浓度 20 ng/mL）和成纤维细胞生长因子 FGF（终浓度 10 ng/mL）。
2. 4°C 保存。
3. 使用前，取适量 NCC 于 37°C 水浴复温 5 分钟。

Note：EGF 与 FGF 稳定性差，建议 NCC 母液 4°C 保存不超过 2 周。

表 1｜NCC 生长培养基配方（总量 555.9 mL，4°C 存放 ≤2 周）

CRITICAL：所有组分均直接加入 NeuroCult NS-A 基础培养基瓶中。瓶身标注 "NCC Complete"，与基础培养基区分。

表 2｜NCC 主要试剂来源

准备工作二：POL（多聚鸟氨酸 + 层粘连蛋白）包被板制备

耗时：1 天

1. 将 0.1% Poly-L-Ornithine 溶液用 PBS 按 1:5 稀释。
2. 按需加入孔中（6 孔板每孔 3 mL）。
3. 37°C 孵育至少 1–4 小时（24 小时亦可）。
4. 将 1 mg/mL Laminin 用 PBS 按 1:200 稀释。
5. 吸去 Poly-L-Ornithine 稀释液后，直接向孔中加入 3 mL Laminin。
6. 37°C 孵育 24 小时。
7. 包被完成。吸去 Laminin 溶液，加细胞前用 PBS 洗 3 次。
8. 包被板可在 37°C 培养箱中放置 1–2 天，或 4°C 保存 1–2 周（4°C 存放时用封口膜包好）。

Note 1：Poly-L-Ornithine 与 Laminin 均为疏水性溶液，会被孔边缘排斥。加液体积必须足够，防止孔边缘裸露——否则 POL 包被质量与寿命都会大打折扣，甚至逐渐从板底剥离。包被后切勿让板干掉。

Note 2：出现干斑或已完全干燥的板不可使用；必要时补加 PBS。

关键资源表

分步方案

一、G4-MB 患者肿瘤处理（耗时：2 周）

Note：强烈建议将新鲜分离肿瘤细胞的 10%（p0，零代）冻存——它们最能代表患者肿瘤本身。

Step 1｜准备：预热恒温摇床至 37°C；水浴解冻红细胞裂解液、200 μL Liberase 分装（2.5 mg/mL）；预热 15 mL 无菌 PBS（pH 7.4）与 NCC 培养基；从手术室取回切除肿瘤。

CRITICAL：处理前肿瘤必须全程置于冰上或 4°C。

Step 2｜肿瘤评估：肿瘤置于生物安全柜内的 10 cm 皿上；拍照记录表型；取代表性 10% 肿瘤组织装入 EP 管用于冻存，置于冰上。

Step 3｜机械解离：用刀片将肿瘤机械切碎，直至原始结构呈糊状。

Step 4｜酶解消化：解冻的 Liberase 与预热 PBS 混匀；用 10 mL 移液管以 7.5 mL Liberase-PBS 混合液冲洗 10 cm 皿两次，收集肿瘤糊于 50 mL 管；置于预热摇床，37°C、中等摇速孵育 15 分钟。孵育期间将 10% 代表性肿瘤组织速冻保存。

Step 5｜收集肿瘤细胞：70 μm 尼龙过滤器架在开口 50 mL 管上；解离后的肿瘤糊分次过筛（每次 5 mL，可用 1 mL 枪头轻搅加速）；5 mL PBS 冲洗过滤器；滤液 430 × g 离心 5 分钟；去上清，1 mL PBS 重悬。

Step 6｜红细胞裂解：根据沉淀红色程度用适量红细胞裂解液重悬（最多 10 mL）；室温（20–25°C）孵育 5 分钟；PBS 按 1:1 稀释裂解液；430 × g 离心 5 分钟；去上清。

Step 7｜计数与铺板：用 1–5 mL NCC 重悬沉淀；10 μL 细胞悬液 + 10 μL 台盼蓝混匀，Cell Countess 计数；留部分细胞以 NCC + 10% DMSO 冻存于液氮；其余细胞稀释至 12 mL NCC，加 120 μL MycoZap，铺入 10 cm 皿。

Note：推荐冻存比例——至少 50% 冻存、25% 用于小鼠连续移植、25% 用于即时的体外与分子实验；可按实际产量与研究优先级调整。

Step 8–13｜建立稳定培养：约 1 周培养并观察球体形成与培养基消耗；球体形成后即可直接用于颅内移植及 POL 板铺板。铺 POL 板时低体积接种（10 cm 皿 7 mL NCC），孵育 24–48 小时待细胞贴附，轻柔补液至 12 mL，37°C 继续培养约 1 周至培养稳定。

Note：皿规格取决于活细胞数——以球体铺满形成汇合面为准。

二、小鼠颅内移植（耗时：6–12 个月）

稳定的患者来源培养建立后，将细胞颅内移植入免疫缺陷 NSG 小鼠进行大量扩增。

Note：荷瘤小鼠通常在 9–12 个月到达终点（体内第 1 代，iP1）；后续连续移植缩短至 6–9 个月。体外细胞可与体内扩增并行使用；此阶段所有不用于移植或体外操作的细胞都应冻存。

Step 14–23｜单细胞制备：收集悬浮的 MBT375 细胞入 Falcon 管；用 P1000 加 1 mL PBS 轻柔冲洗单层（动作要轻，防止贴壁滋养细胞脱落）；原板补加温 NCC 继续培养；收集管 430 × g 离心 10 分钟；沉淀以 500 μL TrypLE + 10 μL DNAse I 重悬；室温下用 P200 频繁吹打解离球体，直至完全分散（最多约 5 分钟）；显微镜下确认单细胞悬液；加 5 mL NCC 稀释；430 × g 离心 10 分钟；小心去上清；按沉淀大小以 500 μL PBS 重悬。

Note：P1000 吹打剪切力大，会导致细胞死亡——务必用 P200。

Note：MBT375 对酶解敏感。胞外 DNA 积累会形成黏性细胞/DNA 团块，一旦出现须立即用枪头吸除。

CRITICAL：MBT375 肿瘤细胞体积极小。所有离心步骤均须 430 × g 离心至少 10 分钟，确保单细胞全部沉降。

Step 24–27｜计数与注射：台盼蓝 + 细胞计数仪双重复计数（Troubleshooting 1）；调整细胞悬液至每 5 μL 含 500,000 个细胞；每只小鼠颅内注射 10 μL（50 万–100 万个细胞）（注射操作详见团队已发表方案）。

Note：初次移植最好用足 100 万个细胞。成瘤率在不同 MBT375 细胞群间存在波动；为保证成功率，可考虑机械解离后直接注射完整小球体（按上一次分离的细胞计数估算小鼠数量）。

三、小鼠 PDX 肿瘤分离（耗时：1 周）

小鼠到达终点（约 9–12 个月）后收获肿瘤细胞，每只鼠脑最多可回收 5,000 万个细胞。

Note：MBT375 脑肿瘤呈红色/粉色，与正常脑组织极易区分，这大大方便了用刀片把肿瘤从健康脑组织上剥离。

Step 28｜从小鼠脑分离肿瘤细胞：取全脑置 15 mL 管，冰冷 PBS 冰上保存（MBT375 肿瘤在 PBS 中很容易自行脱落）；将脑与肿瘤放 10 cm 皿，用刀片尽量剔除正常脑组织；健康脑组织弃入含漂白剂的容器；用 PBS 润洗 10 cm 皿，收集全部 MBT375 入 15 mL 管（最多 10 mL）；用 16 号针头 + 3 mL 注射器吹打 PBS 3–5 次，将细胞团解离为单细胞（机械解离即可，无需额外酶解）；70 μm 过滤器过滤去除鼠源组织碎片；5 mL PBS 冲洗过滤器；430 × g 离心 10 分钟；小心去上清；1 mL 温 NCC 重悬，台盼蓝计数。

Step 29｜成球与上 POL 板：细胞悬液用温 NCC 稀释至 10 mL，铺普通 10 cm 皿；培养 24 小时后连续观察 2–4 天待球体形成（培养物中大量「看似死亡」的碎片样细胞会恢复，不要丢弃）；健康球体形成后收集入 50 mL 管，10 mL PBS 润洗确保收净；430 × g 离心 10 分钟；小心去上清，6 mL NCC 轻柔重悬；铺入 6 孔 POL 包被板的 2 个孔（每孔 3 mL）；孵育 24 小时贴附成单层；按下述方法继续体外维持。

CRITICAL：MBT375 培养物在应激状态（如刚从小鼠脑分离）下可能呈现碎片样的「死亡」外观——请保持耐心，不要丢弃，细胞会逐渐恢复并形成健康培养物。

四、体外培养：MBT375 传代（耗时：1–2 小时）

MBT375 培养物由两个细胞群组成：肿瘤细胞与滋养细胞。传代 = 把肿瘤球解离成更小的球/单细胞 + 酶解滋养细胞单层。

Note：传代时机取决于 3 个因素：球体密度、POL 质量、培养基消耗。

Step 30｜悬浮细胞部分：温浴复温 NCC；收集含悬浮细胞的培养基入 Falcon 管；P1000 加 1 mL PBS 轻柔冲下单层上残留球体，并入同一管；按 Step 31 同步处理贴壁单层；悬浮细胞 430 × g 离心 10 分钟；去上清，0.5 mL 温 NCC 轻柔吹打，把 MBT375 解离成较小球体。

Note：若滋养层尚未汇合而球体已需解离，多余球体可直接用于体外实验，或建立新的 POL 12 孔板培养（注意这种培养体外维持时间可能不长）。

Step 31｜贴壁滋养层部分：冲走悬浮细胞后立即向 6 孔板每孔单层加入 500 μL TrypLE + 10 μL DNAse I（DNAse I 用于减少酶解过程中的碎片聚集）；室温孵育；细胞脱落后用 PBS 冲下收集；重复冲洗直至收净；430 × g 离心 10 分钟；0.5 mL 温 NCC 重悬。

Step 32｜合并回铺：0.5 mL 球体 + 0.5 mL 滋养细胞合并；按细胞数铺入 POL 6 孔板（每孔 1 mL）或 2–4 孔 POL 12 孔板；培养箱孵育 1–2 小时；小心补加 1 mL 温 NCC；再孵育 24 小时；每日观察，适时补加 200 μL NCC 或换掉 50% 培养基体积。

五、体外培养：为实验铺板（耗时：2–3 小时）

与传代略有不同：滋养层单层不解离，只收集悬浮球并酶解为单细胞。

Note：实验多余细胞可回铺原板，或加到另一个 MBT375 培养物上。

Step 33｜收集悬浮球：复温 NCC；收集含悬浮细胞的培养基入 Falcon 管；P1000 加 1 mL PBS 轻柔冲下残留球体并收集；430 × g 离心 10 分钟；原板单层补 2 mL 温 NCC 继续培养；弃上清。

Step 34｜球体酶解为单细胞：球体以 500 μL TrypLE + 10 μL DNAse I 重悬；室温下 P200 积极吹打（注意球体会黏管壁，吹打间隙确保全部悬浮）；显微镜下确认单细胞悬液；加 5 mL 温 NCC 稀释；430 × g 离心 10 分钟。

Note：胞外 DNA 会导致细胞/碎片聚集成团，一旦出现立即吸除，减少细胞损失。

Step 35｜铺板做药物实验：单细胞以 500 μL NCC 重悬；双重复计数；铺平底 96 孔板，每孔约 10,000–30,000 个细胞（MBT375 细胞小、代谢活性低，需较高铺板密度才能保证活力检测读数可靠）；铺板后先孵育 24 小时再开始实验；多余细胞铺入低吸附板，孵育 24–48 小时成球后回铺到母培养物中。

Note：解离成单细胞的 MBT375（尤其数量少时）较难自行重新成球；低吸附板的拒贴壁特性迫使细胞彼此靠近，有助于恢复与成球。

Note：使用小鼠脑来源的 MBT375 群体前，可考虑以人源 Tra1 抗体做流式检测小鼠细胞比例；必要时先用小鼠细胞去除试剂盒纯化，再做药物实验铺板。

六、体外培养：多实验工作流（耗时：1–3 个月）

Note：MBT375 增殖能力低，无法支撑大量体外扩增；从培养物中取细胞做实验会削弱其重建能力。

Step 36–44｜工作流：接种小鼠并开始终点监测 → 终点取全脑分离 MBT375 细胞 → 建立体外培养 → 培养可传代时，一半冻存、另一半铺入 POL 6 孔板 2 孔 → 两孔可传代时，一孔送体内连续移植，另一孔一半铺板做体外实验、一半回铺新 6 孔 POL 板（状态不佳时改铺 4 孔 12 孔板）→ 12 孔板培养长好后合并回 1 孔 6 孔板 → 持续「一半做实验、一半传代」循环 → 当培养物传代后难以恢复时，立即送体内连续移植。

预期结果

• 本方案产生的 G4-MB 模型在体外及小鼠原位连续移植后均保留 G4-MB 特征，体外药物实验数据可重复，突破了临床前开发的一大瓶颈。
• G4-MB 肿瘤细胞在 NCC 培养基中形成球体并聚集成球团；铺到 POL 包被板上后形成支持性滋养细胞贴壁层，球体锚定其上。
• 原位移植成瘤率约 40%–60%（单细胞注射）；直接注射小球体可提高成瘤率，扩增细胞库时更优。终点时每个肿瘤最多可收获 2,000 万–5,000 万个细胞；肿瘤呈特征性红色、易从脑上剥离。
• 与 MYC 扩增的 G3-MB 等更侵袭模型不同，G4-MB 荷瘤小鼠体重开始下降后仍可在临床症状出现后稳定约 1 周——为安排终点与分离实验留出窗口。
• MBT375 体外操作需要一定的「手感」，会随经验积累而提升；小鼠连续移植可增强肿瘤细胞稳健性并改善体外表现。

局限性

• 传代次数有限：MBT375 体外增殖率低，分板会消耗培养物重建健康状态的能力，分配细胞做实验时尤甚。
• 细胞群比例波动：不同移植物来源的培养物中肿瘤细胞与滋养细胞比例可能不同，影响增殖与成球能力；肿瘤细胞数过低时成球受抑，培养物可能不足以支撑研究。
• 大量扩增依赖小鼠连续移植；且移植周期长——移植物需约 30 天稳定期才进入指数生长期，指数期后 9–12 个月到达终点。
• 本方案定位于短期操作并保留 G4-MB 生物学身份；若延长使用时间，建议重新评估肿瘤身份（遗传/表型漂移风险）。

Troubleshooting

问题 1｜计数时检不到活细胞（涉及所有章节）

• 手动调整 Cell Countess 焦平面：MBT375 胞体极小，自动对焦后常被当成碎片，导致活力计数偏低。
• 调焦后仍计数偏低时不要丢弃细胞——应激状态的 MBT375（复苏后、刚从小鼠脑分离）本就呈碎片样外观，精心照料后多可恢复。
• 动作轻柔，禁用 P1000 大力吹打。
• MBT375 耐受不了流式分选的剪切力——分选后的细胞无法用于启动新培养。
• 可用 Neubauer 计数板手工计数作为替代。

问题 2｜小鼠成瘤率低（对应「颅内移植」节）

• 勿注射呈应激碎片样表型的细胞；先在低吸附板 + NCC 中恢复，待健康成球后再移植。
• 轻柔操作，禁用 P1000。
• 提高每鼠接种细胞数。
• 反复失败时改为注射机械解离后的完整球体（不过度操作更能保住成瘤潜能）：球体 PBS 收集后轻柔重悬至注射体积，颅内接种（每个 10 cm 皿培养物至少 5 只鼠）。
• 单细胞注射成瘤率波动大；无需精确细胞数时（如补充细胞库），优先注射完整小球。

问题 3｜患者肿瘤或鼠脑分离后铺板，培养物看起来全是碎片（对应「肿瘤处理」与「PDX 分离」节）

• 不要丢弃，给约 1 周恢复期：细胞会聚成碎片样云团，再逐渐形成球样聚集体；此时轻柔铺到 POL 板上（低体积 NCC），孵育 24–48 小时使培养稳定。
• 1 周后仍无起色：转入更小的孔，或先经低吸附板过渡再上 POL 板。

问题 4｜细胞贴不住 POL / 已建培养物成片掀起（对应「传代」节）

• 检查 POL 包被时 PLO 与 Laminin 用量是否足够——体积不足则孔边缘未浸润，久之 POL 开裂、成片撕脱。
• POL 包被板在 37°C 下约 2 周后质量开始下降：涂层脱落或被锚定球体拉聚，留下空白斑。及时换新板。

问题 5｜酶解时细胞大量死亡，黏性沉淀团块越滚越大（对应「铺板」节）

• TrypLE 必须 + DNAse I 且全程室温进行——胞外 DNA 是团块形成的元凶。
• P200 轻柔吹打加速进程（留意活球体黏壁）；显微镜下全程盯守，单细胞悬液一旦形成、团块即刻吸除。
• 大量沉淀团块 = 球体过密、早该传代：球心因缺氧缺营养已开始死亡，球体呈深棕至黑色。务必在球体变深棕色之前传代。
• 培养基过酸也会致死：新鲜 NCC 呈粉/橙色，变黄即过酸。补液不足以维持颜色时，换 50% 培养基体积——离心回收全部细胞、以新鲜培养基重悬回铺。

问题 6｜培养物无法稳定成健康单层（对应「多实验工作流」节）

• MBT375 对「细胞数 : 面积」比例极为敏感，铺得太稀培养不成熟——提高铺板密度。
• 细胞有限时用 6 孔 / 12 孔板：6 孔板每孔铺 200 万–300 万个细胞；6 孔板状态差时转入更小的孔（如 12 孔板 4 孔），养好后再合并回 6 孔板。
• 铺板时减少培养基体积，促进细胞贴附 POL。
• 上 POL 板之前先在低吸附板预孵 24–48 小时促进成球。

资源与联系方式

• Lead contact：Sheila K. Singh（ssingh@mcmaster.ca）
• Technical contact：Stefan Custers（custerss@mcmaster.ca）
• 材料申请：Chitra Venugopal（venugop@mcmaster.ca）
• 数据与代码：本研究不涉及数据集或代码的发布。

致谢

感谢捐赠肿瘤组织的患者。本研究受加拿大卫生研究院（CIHR, no. 400498）、安大略癌症研究所（OICR）肿瘤干细胞项目、加拿大癌症协会研究所（CCSRI, no. 707420）以及 Box Run Foundation 与 Team Kelsey Foundation 捐助支持；Medulloblastoma Initiative（MBI）及其附属 Cure Group Four Consortium（CGFC）提供了重要支持。特别感谢 Goldsztein 家族。本工作献给 MBI 患者。图形摘要与插图部分使用 Biorender.com 制作。