二抗不必那么浓

Goat Anti-Rabbit IgG H&L (HRP)，WB 可稀释到 1/50000

一支二抗用半年，不是因为耐用，是因为每次都加太多。

很多人加二抗是凭手感，一比两千，或者干脆一比一千。加完背景一高，回头去换一抗，换封闭液，换显影液，就是不回头看一眼二抗的稀释比。

图 1　Western blot 验证结果（图源：Abcam 官网产品页）

浓度和背景是同一件事

二抗的信号来自结合量，背景也来自结合量。

浓度翻倍，目标条带的灰度不一定翻倍，因为膜已经饱和。但膜上那些非特异吸附的位置，会跟着一起变亮。

所以背景高的时候，先把二抗稀释度提一档，往往比换任何试剂都直接。

这支二抗能稀到什么程度

Ab205718，山羊抗兔 IgG 重链轻链，多克隆，HRP 直标。

产品页给的稀释范围比多数人习惯的宽。WB 和 IHC-P 都是 1/2000 到 1/50000，ELISA 是 1/5000 到 1/20000。上限那一档，很多人从来没试过。

试的方法很简单。同一张膜剪成几条，二抗分别按 1/5000、1/20000、1/50000 孵育，其余条件不变。哪一档目标条带还清楚、背景又干净，之后就用那一档。

多数实验室测完会发现，能用的浓度比自己习惯的低三到五倍。省下来的不只是抗体钱。

这支二抗的推荐上限是 1/50000，比多数实验室的习惯低一个数量级。先按上限做一次，能出带就停在那儿，出不来再往回退。

孵育和洗膜的对价

浓度降下来，孵育时间可以不动，也可以略延长。

室温一小时够用。要过夜就放 4 度，别室温过夜，HRP 在室温放久了活性会掉。

洗膜这一步别省。TBST 洗三次，每次五分钟，比洗一次十五分钟有效。中间换液，别让膜一直泡在同一缸里。

显影液现配现用。放了一周的显影液，背景会比新配的高一截，这个变量经常被算到抗体头上。

一条不写在说明书里的经验

二抗稀释液里加点脱脂奶粉，比纯 TBST 干净。

但做磷酸化蛋白时不要用牛奶，酪蛋白本身就是磷酸蛋白，会把信号搅浑。换成 5% BSA。

同一支二抗，用对了浓度，能用出完全不同的结果。

关键参数

图 2　Western blot 验证结果（图源：Abcam 官网产品页）

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