荧光一照全是绿的，先算算二抗浓度
Goat Anti-Rabbit IgG H&L (Alexa Fluor 488)，流式和 IF 通用
荧光显微镜下，视野是均匀的绿。
调低曝光，绿变暗，但依旧均匀。调高曝光，细胞轮廓彻底看不见了，只剩一片亮。
这时候多数人会怀疑一抗不特异。也可能，是二抗加多了。
荧光二抗的容错比 HRP 小
显色法里背景高，你还能靠曝光时间往回救。荧光不行。
荧光二抗浓度一高，未结合的部分会均匀吸附在玻片和细胞表面，形成一层弥散的底噪。它盖住的恰恰是弱信号，而弱信号往往是你要看的那部分。
IF/ICC 的推荐稀释是 1/200 到 1/1000，流式是 1/2000 到 1/4000。这两个数量级差得不小，通用一支抗体的时候，别拿 IF 的浓度去染流式管。
AF488 这个染料
Alexa Fluor 488 的激发和发射位置与 FITC 接近，561 或 640 通道的搭配方案基本可以照搬。
区别在光稳定性。FITC 在汞灯下照几分钟就明显衰减，AF488 撑得久一些，做 z 轴扫描和活细胞延时更从容。
Ab150077 是山羊抗兔 IgG 重链轻链，多克隆，直标 AF488。验证应用覆盖 IHC、ELISA、FCM 和 IF/ICC。
直标二抗省掉一步孵育，代价是每个通道都得单独买一支。四个通道就是四支，预算要提前算。
甘油那 23%
这支二抗的缓冲液里含 23% 甘油，还有 1% BSA 和 0.02% 叠氮钠。
甘油的作用是防冻。负二十度存放时它不会结冰，拿出来直接取用，不用等化冻。取完立刻放回去，别在室温搁半小时。
叠氮钠对荧光染料和活细胞都不友好。做活细胞成像前，确认体系里没有它。
储存说明里还有一句，避光，负二十度可稳定 12 个月。荧光染料见光衰减是不可逆的，棕色管或者锡纸包一下，成本很低。
自发荧光与串色
组织本身会发光。脑组织、肝脏、富含胶原的组织，在 488 通道下常常能自己亮起来。
设一个未染色的切片做本底，先看组织自发荧光有多强，再决定要不要换通道。
多标的时候，AF488 的发射尾巴会漏到相邻通道。补偿要设单标管，别靠软件自动算。
荧光图像的说服力，一半来自信号，一半来自背景有多干净。
关键参数
| 反应种属 | Rabbit |
| 抗原名称 | Rabbit IgG |
| 验证应用 | IHC, ELISA, FCM, IF/ICC |
| 偶联标记 | AF488 |
| 宿主/亚型 | Goat / IgG |
| 抗体类型 | Polyclonal |
| 纯化方式 | Affinity purification Immunogen |
| 推荐稀释 | Flow Cyt 1/2000 - 1/4000；ICC/IF 1/200 - 1/1000 |
| 储存条件 | 短期 +4°C；长期 -20°C |
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