小鼠迷走神经背侧复合体（DVC）的立体定位靶向操作方案

一、背景

迷走神经背侧复合体（Dorsal Vagal Complex, DVC）是胃肠道、心血管系统和呼吸器官迷走传入信息的初级中枢接驳站，由三个结构组成：孤束核（NTS）、最后区（AP）和迷走神经背运动核（DMX）。DVC 中的各类神经元亚群调控摄食行为、血压、呼吸与代谢稳态，近年来 Bdnf、Ppg/Glp-1r、Calcr、Cck、Th、Lepr、GIPR、Gfral、Adcyap1 等细胞类型均通过对其直接操纵得以鉴定。

利兹大学团队此前证明 DVC 的 GABA 能神经元（GABA^DVC）投射至下丘脑弓状核（ARC），通过直接抑制 NPY/AgRP 神经元调控摄食与体重。借助本方案，他们实现了对 Vgat^DVC 细胞的化学遗传激活与抑制（hM3Dq/hM4Di）、轴突投射可视化（CRACM）以及 Vgat^DVC→ARC 末梢的光遗传操控（ChR2）。

创新点

向小鼠 DVC 递送病毒载体在技术上极具挑战，其操作逻辑与常规立体定位注射有本质区别：

1. 入路不同：DVC 位于脑干背侧表面，需经颅后窝（寰枕关节）入路，而非经颅顶开颅——需要头部前屈约 60° 并解剖寰枕膜（AOM）。
2. 靶向窗口极窄：NTS 是一条细长的核团，背侧毗邻 AP、腹侧毗邻 DMX，脱靶注射会带来显著的功能学后果。
3. 零点不同：不以 bregma 为参照，而是以 obex（闩，书写羽 calamus scriptorius） 作为立体定位零点——这是需要在膜解剖后于放大视野下目视确认的表面标志。obex 参照法可重复地把注射物定位于 NTS 内侧。

现有寰枕入路报道仅针对延髓腹侧靶点（如舌下神经核），本方案提供了针对 DVC 的完整验证流程。

机构许可

动物操作遵循英国内政部指南与《动物（科学程序）法 1986》及利兹大学动物福利伦理审查要求。小鼠 12:12 h 光暗周期饲养，自由进食饮水。验证实验使用 2 只 12 周龄 Vgat-Cre 雄性小鼠（JAX 016962）。

注意：在活体动物上应用本方案前，必须取得所在机构与政府主管部门的伦理批准。

注射物的选择

• 验证剂（练手推荐）：甲酚紫（cresyl violet）溶液——明场显微镜下可快速判断靶区准确性，550 nm 荧光通道下可观察扩散范围。替代品：台盼蓝、亚甲蓝（明场 + 红/远红荧光均可视）、印度墨水（仅明场）。
• 实验剂（如病毒颗粒）：必须先做病毒滴度与表达时程研究，确定最优条件。

二、关键资源表

三、实验前准备

步骤 1：玻璃毛细管的制备（约 20 min）

1. 用拉针仪将玻璃毛细管拉制至尖端直径约 40 μm。
• 注：Narishige GD-1 毛细管在 Sutter P-97 上的参考程序：Heat = 600，Filament = 4，Velocity = 60，Delay = 145，Pull = 175。
2. 显微镜下检查针尖直径，确认尖端无断裂、无毛刺。
• 注：无论自动还是手动注射，建议在毛细管上标注体积刻度线。GD-1（外径 1 mm / 内径 0.6 mm）上 1 mm 间隔约对应 250 nL。
3. 用微量注射仪（如 Narishige 气动 IM-11-2）轻柔抽吸把注射物灌入毛细管。
• 关键（CRITICAL）：灌液前先确认所用注射仪的预填充要求——油压式需先用特定油预填充毛细管，气动式则不需要。
4. 上机前试喷少量液体确认液流通畅。
• 关键（CRITICAL）：强烈建议用与实验液黏度相近的溶液先行试喷练习。

步骤 2：手术台准备（约 30 min）

• 关键（CRITICAL）：在实验动物上手术之前，必须先在死后（cadaver）动物上用验证剂确认靶向成功。

1. 手术器械包：
• 常规手术工具与液体：吸水纸、棉签、带刻度毛细管、牵开针、5-0 可吸收缝线、眼膏（0.2% 卡波姆）、7.5% 碘伏、0.9% 生理盐水、镇痛药、解剖针、精细解剖镊（有齿/无齿）、精细解剖剪、手术刀、精细持针器、5 mL 与 1 mL 注射器。
• 自制改造解剖针（图 3），分别改造为：手术刀、钩针、肌肉牵开器、小脑牵开器。
• 手术衣、铺巾。
• 设备：带注射器支架的立体定位仪、恒温加热垫。
• 注：每套可复用器械用透明自封灭菌袋独立包装。若一天做多台手术，备两套完整器械并用玻璃珠灭菌器轮换——一套在用的同时消毒另一套。
2. 动物准备：
• 在手术记录本登记动物信息。
• 复苏保温柜设为约 35°C，用独立温度计核实。
• 注：复苏笼下垫 37°C 控温加热垫，可在小鼠恢复清醒过程中提供温暖环境。
• 备好带标准丰容的新笼：把标准颗粒饲料用 35°C 温水泡软置于培养皿内放入新笼，提供可口易食的食物。
3. 手术台：
• 确认所有器械已高压灭菌、干燥、放凉。
• 注：由于头部前屈 60° 的特殊体位，多数立体定位仪配套的常规麻醉面罩与门齿固定器不适用于 DVC 手术。团队 3D 打印了适配可变头位的麻醉面罩（图 4A），类似面罩也可向专业供应商订购。
• 确认麻醉与氧气供给、面罩回收通畅。
• 1 mL 注射器预抽温热（35°C）无菌 0.9% 盐水，置于 35°C 加热垫上（用于皮下补液）。
• 5 mL 注射器预抽无菌盐水，置于湿冰烧杯中（用于止血与伤口冲洗）。
• 70% 乙醇清洁立体定位仪与手术区域，铺无菌巾。
4. 术者按标准无菌着装流程穿戴（参考 LASA、RAT 指南）。

步骤 3：术前处理与头部摆位

• 注：推荐吸入麻醉而非注射麻醉——麻醉深度可控、可逆、复苏快；注射麻醉有创且存在品系与性别差异，死亡率更高。本方案也完全兼容注射麻醉。

1. 麻醉诱导：

a. 将小鼠放入诱导舱，设 3–5% 异氟烷 + 氧气。

b. 完全麻醉（脚趾夹回反射消失）后转入立体定位仪，鼻部插入麻醉面罩。

1. 麻醉维持与术前准备：
• 全程维持 1%–2% 异氟烷 + 氧气。
• 耳杆固定头部。
• 棉球清理毛发并碘伏消毒。
• 注：建议彻底清洁消毒后电剪去毛——刀片剃毛会产生微擦伤、增加感染风险。
• 眼部涂卡波姆凝胶保湿并避光。
• 给予镇痛抗炎药。
• 关键（CRITICAL）：用药方案须经机构指定兽医或相关机构批准。DVC（尤其 DMX）参与应激状态下心率、呼吸和体温的下调；手术开始、体征平稳后，团队未观察到 DVC 操作引起呼吸心率变化，但仍建议结合实验操纵的预期效果选择平衡的药物方案，防止恢复早期心率进一步下降。
• 皮下注射预温（35°C）盐水补液（1 mL/30 g 体重）。
2. 头部摆位：
• 注：本步开始，DVC 方案与常规脑立体定位手术分道扬镳——在颅骨水平位的基础上，将头部前倾约 60°（图 4B–4D），调整面罩至新位置并确保贴合密封。
• 关键（CRITICAL）：前屈角度至关重要。角度太小，寰枕膜暴露不了；角度太大，气道可能受阻（Troubleshooting 1）。
• 注：头部屈曲后，若听到每次吸气伴随"咔哒"声，立即减小角度——该噪声提示气管被头位挤压。必须持续监测呼吸。

四、分步方案

步骤 4：暴露寰枕关节（10–15 min）

全程在体视显微镜下操作。

1. 在颈部皮肤表面寻找一片平坦的水平区域（图 5A）。
• 注：该平坦区是颈段皮肤在颅骨与 C1 椎骨之间被绷紧撑开所致。
2. 用镊子夹起皮肤，纵向剪开一个 0.5 cm 切口（图 5B，方法视频 S1），暴露皮下组织。
• 提示：后续会用牵开器，对熟练术者 0.5 cm 足够，且利于伤口恢复。
• 可选：若同一台手术还要操作第二个脑区（如 DVC 转导病毒 + 弓状核上方置光纤），建议切口扩大到 1 cm，共用同一皮肤开口，降低感染风险、加快恢复。
3. 同法剪开皮下组织（图 5C，方法视频 S2），暴露左右颈肌（头半棘肌）——两肌自枕骨基部走向 C1 椎骨，中间可见白色中线。
4. 沿中线用刀针切开、钩针轻柔向两侧分开左右肌肉（图 5C′、5D′）。
5. 用刀针把颈肌腹侧层从膜上剥离，牵开器进一步拉开；对侧肌肉重复同样操作（图 5D′、5E′）。
6. 用肌肉牵开器固定已分开的肌肉（图 5E，方法视频 S3），暴露寰枕膜（AOM）——一层跨越枕骨基部与 C1 之间的半透明膜，覆盖寰枕关节（AOJ）。
• 关键（CRITICAL）：解剖空间有限，建议用尖端下弯并磨钝的 19G 针头做牵开器，防止损伤肌肉或撕裂 AOM。
• 注：本阶段结束时，应获得约 1 cm 宽的视野平面，可辨认：上方枕骨（粉红色）、中部小脑腹侧（浅粉色）、下方延髓（白色）、正中后髓静脉（红色）。

步骤 5：解剖寰枕膜（10–15 min）

• 注：正中后髓静脉自侧方进入颅腔。解剖必须在静脉的对侧进行，避免损伤静脉。

1. 用刀针在 AOM 与枕骨交界处做垂直穿孔。
• 注：穿孔释放 AOJ 内压并放出脑脊液（CSF）。
• 关键（CRITICAL）：颅内压释放可能在恢复期造成不适与疼痛，强烈建议采用主动式术后镇痛（见步骤 22）。
2. 用钩针配合刀针，向尾侧和对侧解剖 AOM（图 5E′、5F′，方法视频 S4）。
• 关键（CRITICAL）：靠近静脉时，先用牵开针把 AOM 挑起，给刀针留出在静脉上方割膜的空间。
• 注：必要时用无菌棉签轻柔清理 CSF 或血液。小量渗血可接受（微小血管损伤）；但若伤及正中后髓静脉表现为出血不止，小鼠恢复期可能发生脑卒中，建议立即人道处死（Troubleshooting 2）。
• 注：AOM 完全解剖、内压释放后，延髓与小脑会轻微膨出（图 5F）。
3. 用小脑牵开针把小脑基底部向吻侧牵开，直至看见 obex（图 5F′–5G′，方法视频 S5；Troubleshooting 3）。
• 注：obex（书写羽）是可见脑干表面尾端的一个小 V 形凹口；AP 是 obex 吻侧紧邻的略微隆起、血管丰富的区域。目标是暴露 obex 与牵开器之间约 2 mm 的区域（图 5G）。
4. 把牵开器固定在所需位置。
• 注：照明与放大倍数务必充足。术野被血或 CSF 遮挡时，用生理盐水轻柔冲洗并以吸水纸吸除。

步骤 6：向 NTS 双侧给药（10–20 min）

本节描述向背侧脑干内侧 NTS 递送注射物。AP 与 DMX 也可用同样技术靶向，但坐标需另行标定。

1. 把带刻度的玻璃毛细管装到立体定位注射支架上。
2. 灌入注射物（Troubleshooting 4）。
3. 再吸入少量空气——当毛细管尖端接触 CSF 时，这层空气可防止液体被毛细作用回吸。
4. 将毛细管尖端移到 obex 上方并轻触 obex（图 6A）。
5. 把立体定位坐标归零于此位置。
6. 靶向 NTS：稍微抬起毛细管，移动至 obex 参照坐标 AP −0.25 mm、L +0.25 mm（图 6B），针尖此时位于 AP 与 NTS 连接处的上方。
7. 腹侧下移 DV −0.25 mm。
8. 开始注射：250 nL，速度 50 nL/min。
9. 注射后针尖留针 5 min。
10. 缓慢退针。
11. 移至对侧 L −0.25 mm（DV −0.25 mm），重复注射（图 6C，方法视频 S6）。

• 可选：也可用微升进样针，但推荐玻璃毛细管。团队提供了最细 Hamilton 34G 钢针与 GD-1 拉制毛细管的口径对比（图 6D）——最细 34G 钢针仍比拉制毛细管宽约 4 倍。
• 关键（CRITICAL）：部分小鼠的正中后髓静脉会沿 AP–NTS 连接处一侧潜行入脑。可用毛细管尖端轻柔把静脉拨到一旁（Troubleshooting 5）。

步骤 7：关创（约 10 min）

1. 用无菌盐水轻柔冲洗 AOJ，清除凝血块。
2. 缓慢把小鼠头部复位至近水平位。
3. 盐水冲洗保湿颈肌，无菌手法轻柔按摩使肌肉复位。
• 注：一滴手术胶可帮助两侧肌肉重新黏合。
4. 对合皮肤，用无菌盐水棉签从内向外清洁。
5. 可吸收缝线缝合关创。
• 关键（CRITICAL）：术后 48 h 内必须密切监护，防止伤口裂开（Troubleshooting 6、7）。单笼饲养可作为防止互相理毛致伤口裂开的对策，但需伦理批准且可能影响实验设计。

步骤 8：术后监测（48 h 至 1 周）

• 注：鉴于 DVC 参与呼吸调控、能量平衡与胃肠功能，术后监测需比多数脑区手术更严密。建议术后至少 7 天监测以下三方面：

1. 福利评估：术后第一周每天至少一次用小鼠鬼脸量表（Mouse Grimace Scale）评分，并结合姿态、被毛、活动度与呼吸模式等体征。
• 关键（CRITICAL）：继续执行批准的镇痛抗炎方案。本方案涉及膜解剖中的 CSF 释放与颅内压降低，建议采取主动而非被动的镇痛策略。
• 关键（CRITICAL）：脑干手术存在呼吸抑制与吞咽功能障碍风险。若体重减轻超过批准阈值或出现呼吸窘迫，立即执行人道终点标准（Troubleshooting 8）。
2. 体重记录：术前及恢复期每日称重。
• 关键（CRITICAL）：麻醉与手术本身会造成体重下降属预期；但靶向 DVC 时，体重进一步下降（或增加）可能是预期科学结果。若为非预期变化且超过批准阈值，执行人道终点。
3. 进食与水合监测：恢复期持续观察。
• 关键（CRITICAL）：术后 48 h 内进食减少属预期；但进食模式改变可能正是靶向 DVC 的实验目的。若为非预期变化且体重变化超过阈值，执行人道终点。

五、预期结果

在实验手术前，应先在小鼠尸体上充分验证坐标与技术：向尸体注射甲酚紫，染料定位于 NTS 内侧、几乎不扩散到 AP 或 DMX，即视为靶向成功（Troubleshooting 9）。当然，方案的最终验证仍需确认实验剂的表达、扩散与预期实验结局。

对实验动物，成功的病毒转导表现为双侧限于 NTS 的报告基因表达，跨约 4–6 张冠状切片（约 200–400 μm）。团队在同一只 Vgat-Cre 小鼠右侧 NTS 转导红色报告病毒（AAV-hSyn-DIO-mCherry）、左侧转导绿色报告病毒（AAV-hSyn-DIO-EGFP），转导 8 周后灌流取脑、冠状切片、荧光显微镜成像（图 7），苏丹黑 B 或 DAPI 复染均可清晰限定表达范围。DVC 注射的准确性另经已发表的功能学读出进一步验证。

六、局限性

1. 术者技术是首要限制：关键难点是不伤正中后髓静脉地解剖 AOM——一旦失误可能不得不人道处死动物。上活体之前必须在尸体上练到技术合格。
2. DVC 是细长的复合结构（AP、NTS、DMX 三者相邻）。若实验设计采用交叉遗传策略（如 Cre/LoxP），务必仔细评估脱靶可能，优化：① 病毒滴度/浓度；② 注射体积；③ 基于 obex 的坐标微调。
3. 转导体积受限：超过 300 nL 即有脱靶转导风险。需要更大覆盖范围时，可考虑沿吻尾轴设置多个注射位点。

七、Troubleshooting（问题与对策）

八、资源与数据可用性

• 通讯/技术联系人：Pablo B. Martinez de Morentin（p.demorentin@leeds.ac.uk）
• 材料：方案中使用的 3D 打印麻醉面罩等可联系索取。
• 数据与代码：本文呈现代表性组织学数据，其余数据可向通讯作者索取。

一句话总结：以 obex 为零点、经寰枕膜入路（头部前屈 60°）、双侧各 250 nL @ 50 nL/min，即可精准靶向小鼠 DVC 的内侧 NTS——脑干深处的"肠-脑轴"枢纽，其实比想象中触手可及。