FFPE 组织延伸多色免疫荧光染色：序贯漂白-复染（Bleach-and-Stain）方案

原文：Stahl E, Zhang Y, Schlegel JA, Thiel J, Liang C, Schroth W, Dong M. Protocol for extended-plex immunofluorescence staining of FFPE tissues using a sequential bleach-and-stain approach. STAR Protocols, 2026-08-27。

DOI: 10.1016/j.xpro.2026.104806 ｜ PMCID: PMC13544394

单位：Dr. Margarete Fischer-Bosch 临床药理研究所 & 蒂宾根大学（斯图加特）；维尔茨堡大学生物信息系

摘要

多重免疫荧光让复杂生物系统的空间分析成为可能，但 plex 数越高，成本和工作流复杂度也越高。本方案利用序贯"漂白-复染"策略，把基于酪胺信号放大（TSA）的多重免疫荧光从标准 6 色扩展到 16 个标志物。内容覆盖组织准备、抗体组合（panel）建立、序贯染色、荧光团漂白、图像采集，以及拼接、配准、叠加等计算图像处理。工作流适用于福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）的人肿瘤和淋巴组织，并且可以通过选择合适的常规抗体灵活扩展。

背景与思路

这套流程把 Akoya 的 Opal 荧光染色体系（TSA 放大）从标准 6 重扩展到 16 重，配合 PhenoImager 成像平台做靶向空间分析。它最大的卖点是只需要经过常规免疫组化（IHC）验证的普通抗体——不需要 PhenoCycler 那类寡核苷酸条码化抗体的预制 panel。Opal 荧光团可以指派给任何一个已验证的抗体，panel 想扩就扩、想改就改；而 Oligo 条码平台必须订购预定义的偶联抗体组，改 panel 又贵又慢。

需要明确的是：本方案不是要取代能测 60+ 标志物的高重空间技术，而是给使用常规 IHC 抗体和 TSA 工作流的实验室提供一个易得、灵活的中重（low/mid-plex 到 16-plex）替代方案。虽然流程用 Akoya 试剂和成像系统描述，但并不被专有平台锁死——Biotium CF 染料等替代酪胺荧光团、共聚焦等其他荧光成像平台同样可以套用这套漂白-复染逻辑。

与已有的迭代方法相比：t-CyCIF 用 4.5% H₂O₂ + 24 mM NaOH 化学光漂白；IBEX 用硼氢化锂（LiBH₄）快速化学漂白。本文专门针对五个 Opal 荧光团（480、520、570、620、690）的迭代漂白做了优化——其中 Opal 520 和 620 恰恰是 LiBH₄ 类方案（IBEX）淬灭不掉的。化学光漂白最终定型为 3% H₂O₂：更高浓度会导致组织脱片、反复染色周期中组织稳定性下降，而 3% 仍能保证荧光团充分灭活。

图像配准与叠加是下游分析准确性的关键。作者自研了一条 Python 配准管线（GitHub 开源 Stitching_Alignment_Tool），把拼接、配准、叠加整合成一个自动化批处理流程，最终输出单个合并的 OME-TIFF 文件（含所有通道的已对齐图层），供 QuPath 做下游可视化和定量。QuPath 的 Align 扩展是可选替代。

验证组织来自回顾性研究的卵巢癌、肺癌和乳腺癌 FFPE 样本（石蜡块室温存放最长 5 年仍可用），另在扁桃体、胰腺导管腺癌、套细胞淋巴瘤、肝细胞癌上验证了普适性。

Panel 建立五步走（正文开始前必须完成）

1. 抗体验证：多重染色前，先用显色 IHC 逐一验证每个抗体的特异性和最佳染色条件。以抗体说明书为起点，改变 HIER 条件（pH 6 或 9 缓冲液）、抗体稀释度和孵育时间优化信噪比（SNR）。从温和条件起步（pH 6、推荐稀释度、30 min）。建议请病理医生把关染色模式。
2. 定位实验（positioning experiment，约 2 天）：同一抗体在经历 1、3、6 次不等 HIER 后染色效果可能不同（反复热修复会改变表位可及性/完整性）。用连续切片测试每个抗体在不同轮次位置的表现；测试期间每个抗体固定用同一种荧光团，保证强度差异只反映位置效应。
3. 单色优化：逐一做 Opal 单色染色，与显色 IHC 对照比较染色模式、荧光强度和 SNR。

• 关键（CRITICAL）：亮荧光团（Opal 480、520）给低丰度标志物（这两个通道组织自发荧光高，必须靠亮染料补偿）；暗荧光团（Opal 690、780）给高表达标志物，使各通道信号均衡。
• 关键（CRITICAL）：共定位标志物避免相邻荧光团，减少光谱渗漏。
• 再优化抗体/Opal 稀释度、孵育时间和曝光时间。

1. 多重优化：全部标志物合成完整 panel 后，重新审视荧光团亮度分配、抗体位置和稀释度，微调以平衡信号、降低串色。
2. Plex 级扩展：通过迭代漂白-复染在同一张片子上增加 plex 数。每轮之后重评染色质量，必要时调整条件再进入下一轮。

• 关键（CRITICAL）：全程监控组织完整性，确保多轮循环后染色质量一致。

关键资源表（节选）

抗体（示范 16-plex panel）

抗体	稀释度	来源	货号
兔多抗 αSMA	1:100	Abcam	ab5694
兔单抗 CD3	1:100	Cell Marque	103R-94
鼠单抗 CD68	1:300	Cell Marque	168M
兔多抗 phospho-Histone H2A.X (Ser139)	1:75	CST	2577
兔多抗 Cleaved Caspase-3	1:75	CST	9661
兔单抗 CD4	1:100	Cell Marque	104R
兔单抗 Granzyme B	1:50	CST	46890
兔单抗 CD8	1:100	Cell Marque	108R
鼠单抗 pan-Keratin (AE1/AE3)	1:50	CST	67306
鼠单抗 Ki67	1:100	Agilent	M724029
兔单抗雌激素受体 ER	即用型	Ventana	790-4325
兔单抗 PD-L1	1:100	CST	13684
单抗 CD20	1:100	Cell Marque	120M-84
鼠单抗 CD31	1:800	CST	3528
鼠单抗 FoxP3	1:100	eBioscience	14-4777-82
兔单抗 CD45	1:100	CST	13917
兔多抗 H3K27ac	1:400	Abcam	ab4729

主要试剂与耗材

类别	品名	来源/货号
核心试剂盒	Opal 6-Plex Manual Detection Kit（含 10× AR6、抗体稀释/封闭液、Plus 放大稀释液、6 种 Opal 荧光团、DMSO、10× Spectral DAPI、1× Opal Anti-Ms+Rb HRP 二抗）	Akoya，NEL811001KT
脱蜡	Neo-Clear 二甲苯替代品	Sigma-Aldrich，1.09843
固定	中性缓冲福尔马林 4%（NBF）	Carl Roth，P087.4
漂白	30% 过氧化氢（H2O2）	Carl Roth，CP26.5
封片	SlowFade Diamond 抗淬灭封片剂	Invitrogen，S36963
封片（经济替代）	Neo-Mount 封片剂	Sigma-Aldrich，1.09016
粘附载玻片	Polysine 阳电荷载玻片	Epredia，J2800AMNZ
染色缸/架	EasyDip 染色缸 + 染色架	Simport，M900-12AS / M905-12DGY
蒸锅	Rommelsbacher DGS 855	用于 HIER
切片机	Leica RM2255 全自动轮转切片机 + Feather A-35 刀片
光源	全光谱灯（Waldmann TND 1400/D50/D）+ 日光灯（Beurer TL 30）	光漂白用
四孔方形培养皿	Sarstedt 94.6077.307	漂白容器
软件	QuPath 0.4.4/0.5.1/0.6.0；StarDist；inForm 3.1.0；Phenochart 2.2.0；Fusion 2.3.1；Python 3.8.20 + numpy 1.22.2 / tifffile 2022.2.9 / scikit-image 0.19.2 / pystackreg 0.2.5 / pandas 1.4.1；GraphPad Prism 11
代码	Stitching_Alignment_Tool	github.com/Zha2Git/Stitching_Alignment_Tool（Zenodo: 10.5281/zenodo.21048347）

试剂配方

10× TBS

试剂	终浓度 [M]	用量 [g]
氯化钠	1.37	80
氯化钾	0.034	2
TRIS	0.028	3.39
TRIS 盐酸盐	0.22	35
dH₂O	—	定容至 1000 mL

调 pH 至 7.4。4 °C 可存数月。

1× TBST

试剂	终浓度	用量 [mL]
10× TBS	1×	500
Tween 80	0.1%	5
dH₂O	—	4500

总体积 5 L。21 °C 存放 2 周内用完，或 4 °C 存数月。

其他工作液

• 1× Target Retrieval Solution（柠檬酸，pH 6）：10× 液按 1:10 用 dH₂O 稀释。4 °C 存放、3 个月内用完。
• 1× Target Retrieval Solution（pH 9）：同样 1:10 稀释。4 °C 存放、3 个月内用完。
• Opal 480/520/570/620/690：各加 75 μL DMSO 重悬。4 °C 避光可存 3 个月。
• Opal 780（Polaris）：加 300 μL dH₂O 重悬。4 °C 避光可存 3 个月。
• Opal 工作液：480–690 用 1× Plus Amplification Diluent 按 1:100 现配；Opal 780 用抗体稀释/封闭液按 1:25 现配。
• DAPI 工作液：3 滴 DAPI 加 1 mL 1× TBS。4 °C 避光、2 周内用完。

漂白液（用前现配，终体积 10 mL）

• 自发荧光漂白液（4.5% H₂O₂）：8.5 mL 1× TBS + 1.5 mL 30% H₂O₂。
• 荧光团漂白液（3% H₂O₂）：9 mL 1× TBS + 1 mL 30% H₂O₂。

分步方案

除非特别说明，所有孵育均在 21 °C 进行；试剂体积以完全覆盖组织为准（通常每片 100–300 μL）。清洗步骤把片子竖直放入装有足量液体的染色缸，液面完全没过组织。

一、切片与 FFPE 载玻片准备（2 h 至过夜）

1. 切片机切 3 μm 厚 FFPE 切片。（厚度 2–5 μm 一般对染色无明显影响。）

• 注：切片前把蜡块 −20 °C 冷却至少 30 min，切得更平、不易卷曲褶皱。

1. 切片转入 35–40 °C 预热水浴展片，然后捞到载玻片上。使用静电+生化双粘附载玻片提高组织贴附。

• 关键（CRITICAL）：富含脂肪或结缔组织的样本（如乳腺组织），水浴降到 30 °C 并尽快捞片，维持结构完整、减少组织扩散。

1. 室温晾 10 min，再 56–60 °C 烤片 8–24 h。

• 注：烘烤能增强粘附，但不要超过 24 h，否则热修饰/遮蔽表位、组织质量下降。
• 暂停点：新切组织最好立即使用。如需存放：干燥无尘片盒室温 1–2 周；干燥器 1–2 个月；−20 °C 或 −80 °C 可存数月。−20 °C 长期存放形态学基本相当，抗原性可能轻度下降。作者团队检测过存放一年的卵巢/肺/乳腺癌样本，信号质量未见可见劣化。

二、复水与抗原修复（2–3 h）

1. 载玻片上架。（−20 °C 取出的片子先回温至室温。）
2. 室温下在约 150 mL Neo-Clear 二甲苯替代液中脱蜡 20 min。
3. 梯度酒精复水：100% 乙醇 3 min → 96% 乙醇 3 min → 70% 乙醇 3 min。
4. dH₂O 冲洗。
5. 4% 中性缓冲福尔马林后固定 20 min。（固定期间，染色缸内配制 1× Target Retrieval Solution（pH 6 或 pH 9），入蒸锅预热 20 min。）

• 注：第一轮通常用 pH 9 充分修复表位；后续抗体剥离轮次用 pH 6。视抗体而定，pH 9 能不用就不用（对组织完整性影响大于 pH 6）；多个 pH 6 轮次也可替代 pH 9 处理。

1. dH₂O 冲洗。
2. 抗原修复：转入蒸锅内预热好的 1× 修复液（pH 6 或 pH 9），松盖，95 °C 煮 30 min。

• 关键（CRITICAL）：预热是 HIER 充分的前提。
• 替代方案：水浴锅、高压锅或微波炉亦可。

1. 取出染色缸开盖，室温冷却 20 min。（切勿让片子干掉。）
2. 1× TBST 洗 2–3 次，每次 3 min。

• 暂停点：片子可在 4 °C TBST 中存放最多 2 天。

三、自发荧光去除（可选，1.5 h）

在高自发荧光组织（富含纤维或血管者）上推荐做。做法是把片子放进漂白液，置于上下两盏 LED 灯之间光照（灯架可 3D 打印，STL 文件见原文）。定量比较显示 H₂O₂ + 光照联合处理的去自发荧光效果显著优于任一单独处理。

• 关键（CRITICAL）：谨慎评估此步——可能影响组织完整性。
• 关键（CRITICAL）：必须在第一次煮片（步骤 10–12）之后进行；漂白后再加热会加重脱片。
• 关键（CRITICAL）：H₂O₂ 需佩戴手套和护目镜操作；光照装置按厂商安全规范使用。

1. 1× TBS 洗 3 次，每次 3 min。（洗涤期间每片现配 8 mL 4.5% H₂O₂ 漂白液。）

• 关键（CRITICAL）：漂白液用前现配。

1. 自发荧光去除（共 50 min）：片子平放入四孔方形培养皿，每片用 8 mL 漂白液完全覆盖组织；培养皿直接放在日光灯上、全光谱灯架在皿盖上方，双面光照 45 min。
2. 1× TBS 洗 1 次，3 min。
3. 1× TBST 洗 2–3 次，每次 3 min。

• 暂停点：4 °C TBST 可存 2 天。

四、Opal 480–690 染色（每个荧光团 2.5–3 h）

以下 17–27 步为"一个标志物一轮"的标准染色循环，按定位实验确定的抗体-Opal 配对逐轮重复：

1. 封闭：湿盒内每片加 100–300 μL（2–3 滴）1× 抗体稀释/封闭液，室温 10 min。（同时配制一抗工作液：一抗用 1× 抗体稀释/封闭液稀释。组织须完全覆盖、无气泡。）
2. 1× TBST 洗 1 次，3 min。
3. 一抗孵育：湿盒内每片加 100–300 μL 一抗工作液，室温 30 min（以显色 IHC 和单色优化的结果为准）。
4. 1× TBST 洗 2–3 次，每次 3 min。
5. 二抗孵育：每片加 100–300 μL 1× Opal Anti-Ms + Rb HRP，室温 10 min。
6. 1× TBST 洗 2–3 次，每次 3 min。（同时预热下一轮剥离用的 pH 6 修复液 20 min；配制 100–300 μL 对应 Opal 工作液。）
7. 信号放大：每片加 100–300 μL 对应 Opal 荧光团工作液，室温 10 min。

• 注：荧光团顺序按定位实验和单色优化结果执行。
• 关键（CRITICAL）：Opal 780 必须放在最后一个，其作用机制略有不同。

1. 1× TBST 洗 2–3 次，每次 3 min。

• 暂停点：4 °C TBST 可存 2 天。

1. 抗体剥离：转入预热好的 pH 6 修复液，松盖，95 °C 煮 30 min。

• 关键（CRITICAL）：预热是 HIER 充分的前提。替代：水浴、高压锅、微波炉。

1. 取出冷却 20 min。（勿干片。）
2. 1× TBST 洗 2–3 次，每次 3 min。

• 暂停点：4 °C TBST 可存 2 天。

回到步骤 17，用下一个抗体-Opal 配对重复，直至 480–690 的标志物全部染完；最后一个荧光团 Opal Polaris 780 进入下一步。

五、Opal 780 染色（3.5–4 h）

重复步骤 17–21（封闭 + 一抗 + 二抗），然后：

1. 1× TBST 洗 2–3 次，每次 3 min。（配制 TSA-DIG 工作液：1:100 于 1× Plus Amplification Diluent。）
2. TSA-DIG 信号放大：每片 100–300 μL，室温 10 min。（同时预热剥离用 pH 6 修复液。）
3. 1× TBST 洗 2–3 次，每次 3 min。
4. 抗体剥离：pH 6 修复液 95 °C 煮 30 min（同步骤 25 要求）。
5. 取出开盖冷却 20 min。（勿干片。）
6. 1× TBST 洗 2–3 次，每次 3 min。（配制 Opal 780 工作液：1:25 于 1× 抗体稀释/封闭液。）
7. Opal 780 信号生成：每片 100–300 μL，室温孵育 1 h。

• 注：此步之后不得再做 HIER。

六、复染与封片（30 min）

1. 1× TBST 洗 2–3 次，每次 3 min。（同时以 3 滴 DAPI + 1 mL 1× TBS 配制 DAPI 工作液。）
2. 复染：湿盒内每片加 150 μL DAPI 工作液，室温 5 min。剩余 DAPI 工作液弃去。
3. 1× TBST 洗 1 次，2 min。
4. dH₂O 洗 1 次，2 min。
5. 避光防尘晾干。
6. 封片：每片滴 2–3 滴 SlowFade Diamond 封片剂，盖盖玻片。避免气泡，让封片剂均匀铺展覆盖全部组织。

• 关键（CRITICAL）：必须用液体封片剂，方便后续轮次前揭下盖玻片。
• 经济替代：10% 甘油（v/v，1× TBS 配）约 200 μL 封片。
• 注：封片前用气吹除尘。

七、成像（1 h，Akoya PhenoImager 平台）

系统配 LED 光源，支持 20× / 40× 物镜，高速相机多光谱采集（440–780 nm）。

1. 开机，打开 PhenoImager Fusion 显微镜，启动 Fusion 2.3.1 软件。
2. 装载玻片：轻推入位至弹簧卡扣；每架最多 4 片；载架推入电动 XYZ 平台直至完全过门。

• 可选维护：明场参考片每两周采一次（约 5 min）；封片荧光参考每月一次（约 20 min）。

1. 新建或载入荧光 Protocol：Imaging Mode 选 Fluorescence，Filter Set 选 Opal 7-color，选/建 Study，创建。
2. 编辑 Protocol：分辨率选 20× 或 40×；Select Bands 勾选要扫的通道并指定显示颜色；Scan Exposures 窗口中移动 XY 到组织、Z 粗对焦后 Autofocus，逐通道 Autoexpose（可手动改 0.1–2000 ms），保存 Protocol。
3. Scan Slides 界面里为每片指定 Task（Scan Slide / Ignore）、Study、Protocol 和 Slide ID，点击 Scan Slides 开始扫描，完成后核对结果弹窗。
4. 取下载架与玻片，关机。

八、荧光团灭活（每轮循环之间，3 h）

每轮染色成像结束后，用"光照 + 3% H₂O₂"联合灭活荧光信号，为下一轮复染腾出通道，同时保持组织形态。定量数据显示各 Opal 通道在不同 FFPE 组织（扁桃体、PDAC、卵巢癌、肺癌、套细胞淋巴瘤、乳腺癌、肝癌）上均能高效去信号。

1. 揭盖玻片：片子竖直浸入无染色架的 1× TBS 染色缸 5 min，然后垂直缓慢抽出——盖玻片会留在缓冲液里。

• 关键（CRITICAL）：若盖玻片不自行脱落，延长浸泡，切勿手动抠取（会伤组织）。
• 关键（CRITICAL）：H₂O₂ 个人防护同前。

1. 1× TBS 洗 3 次，每次 3 min。（现配每片 8 mL 3% H₂O₂ 荧光团漂白液。）
2. 第一轮灭活（65 min）：片子平放入四孔皿，每片 8 mL 漂白液完全覆盖；下日光灯、上全光谱灯双面光照 60 min。
3. 第二轮灭活（65 min）：更换新配漂白液，再光照 60 min。
4. 1× TBS 洗 1 次，3 min。
5. 1× TBST 洗 3 次，每次 3 min。

• 注：漂白过程中因氧化会产生气泡。
• 关键（CRITICAL）：疏水 barrier 笔会干扰后续染色循环——使用过 PAP 笔的片子，漂白和煮片前必须彻底清除残迹。

九、后续染色轮次（每个 Opal 荧光团 2.5–3 h）

每个后续轮次 = 重复"Opal 480–690 染色"（步骤 17–27）+ 荧光团灭活（步骤 50–55）+ 成像（步骤 41–49），最后以 Opal 780 染色（28–34 步）+ 复染封片收尾。

注意：Opal 780 不能跨轮次重复使用——TSA-DIG 共价结合在组织上，下一轮加 Opal 780 时该标志物会被重新着色。

十、inForm 光谱拆分（15 min/图像）

光谱拆分去除自发荧光并分离重叠光谱。操作视频见原文链接（耶拿大学云盘）。软件版本 inForm 3.1.0。

1. 准备未染色对照片：同一肿瘤类型取一张未染色切片，走完所有循环的抗原修复、封闭、二抗孵育（含 TBST 洗涤），用于生成拆分光谱库；可加做单色对照提高光谱精度。
2. 生成拆分库：Phenochart 打开未染色图像 → 登录（填姓名缩写即可）→ Stamp > inForm Projects > Set stamps → 关窗自动保存 → 打开 inForm：File > Open > Image 选择图像，Edit Markers and Colors 输入标志物名与颜色，用 pen tool 圈出自发荧光区域加入光谱库，Prepare image 后用"眼睛"图标检查，File > Save > Algorithm 保存算法（同类型肿瘤的染色切片通用）。
3. 对染色切片拆分：Phenochart 打开染色图像 → ROI > Acquisition > inForm Batch 沿组织画线 → inForm 选 Batch Analysis，载入算法、设导出目录、勾选 Component Images（导出多页 TIFF）、添加图像、Run。输出为分块组件图像，需后续拼接。

• 注：若用 PhenoImager HT 2.0，扫描时自动拆分，无需此步。

十一、图像拼接与配准（每片约 60 min，原始数据约 5 GB TIFF）

把连续染色轮次的图像拼接、对齐并合并为单个多层图像。操作视频见原文链接。建议硬件至少 32 GB 内存；推荐 Anaconda 发行版（含 Python + Jupyter Notebook）。

• 关键（CRITICAL）：开始前确保 Python 环境可用。
• 关键（CRITICAL）：为兼容脚本，使用 Python 3.8.20 + numpy 1.22.2、tifffile 2022.2.9、scikit-image 0.19.2、pystackreg 0.2.5、pandas 1.4.1、Jupyter Notebook + ipykernel。其他版本可能需少量改代码。

1. 下载安装：从 GitHub（Stitching_Alignment_Tool）下载代码，cd 到代码目录，python3 -m pip install -r requirements.txt（无管理员权限加 --user）。
2. 拼接：确认拆分后图像瓦片文件名含右下角顶点坐标（如 _[x_coordinate, y_coordinate]_）；每张显微图像的瓦片放一个子文件夹，全部子文件夹放在同一根目录下。在 OmeTiff_Stitching_Batch_Processing.ipynb 里设根目录后运行——程序批量拼接所有子文件夹并写日志，按坐标计算目标画布尺寸、逐瓦片定位，输出 XXXX_Combined.ome.tif。
3. 对齐与合并：把拼接图复制进 source 文件夹（保持 XXXX_Combined.ome.tif 命名）；在 channel_name 目录里按图像名重命名文件并指定每个图层通道名；打开 main.ipynb 核对参数后运行。对齐单图输出到 aligned 文件夹（文件名带 al 后缀）。默认同时输出两个最终文件：未压缩的 final_image.ome.tif 和金字塔压缩的 pyr_final_image.ome.tif（供 QuPath 快速浏览）。金字塔图约为拼接输入总和的 1.5 倍——例如三张 2792×3720 像素、各 316 MB 的图像合并成同分辨率 16 色图约 1.4 GB。

十二、图像分析（QuPath，30 min/片）

兼容 QuPath 0.4.4 / 0.5.1 / 0.6.0。分析前安装 StarDist 扩展用于细胞核分割。

1. QuPath 新建 Project、加入图像。
2. 默认设置：Shift+C 打开亮度对比对话框，双击通道改名、拖动 min/max 调亮度；在 Annotations 页 "Populate from image channels" 导入标志物列表；沿组织画注释。
3. 细胞检测：StarDist 路线——核对 Image > Pixel 宽高，Automate > Show script editor 载入对应像素尺寸的 "StarDist cell segmentation" 脚本，选中注释运行，弹出窗口选 stardist_cell_seg_model.pb，保存项目。替代：QuPath 自带 Analyze > Cell detection 调阈值运行。
4. 可选：运行 "Remove small detections, artifacts" 脚本去除小检测和伪迹（可调 minArea）。
5. 训练标志物分类器：Classify > Training images > Create duplicate channel training images（勾选 Initialize Points annotations，每通道复制一份图像）；在 Annotations 页为每个标志物建 Class；对每张复制图像，添加正/负细胞点注释（数量相近），类别设为对应 Marker 与 Ignore；Classify > Object Classification > Train object classifier，Live update 实时预览，以标志物命名保存；回原图像依次 Load object classifier 应用。
6. 检查与导出：Measure > Show annotation/detection measurements 核对；Measure > Export measurements 导出数据。

预期结果

该 16-plex panel 在扁桃体、胰腺导管腺癌、卵巢癌、肺癌、套细胞淋巴瘤、乳腺癌、肝细胞癌等多种组织上验证，兼具组织普适性和单张切片内的标志物覆盖广度。

示范 panel 面向免疫浸润与细胞周期状态，分 3 轮 Opal 染色、轮间化学光漂白：

轮次	位置	标志物	稀释度	荧光团
Cycle 1	1–6	αSMA、CD3、CD68、p-H2A.X (γH2A.X)、Cleaved Caspase-3、CD4	1:100 / 1:100 / 1:300 / 1:75 / 1:75 / 1:100	Opal 480 / 520 / 570 / 620 / 690 / 780
Cycle 2	7–11	Granzyme B、CD8、pan-Keratin (AE1/AE3)、Ki67、PD-L1	1:50 / 1:100 / 1:50 / 1:100 / 1:100	Opal 480 / 520 / 570 / 620 / 690
Cycle 3	12–16	CD20、CD31、FoxP3、CD45、H3K27ac	1:100 / 1:800 / 1:100 / 1:100 / 1:400	Opal 480 / 520 / 570 / 620 / 690

三个 panel 的图像经拆分、拼接、Python 对齐后合并为一张包含全部 16 个标志物、细胞级精确配准的高分辨率图像，可直接做共定位、细胞邻域和空间互作等单细胞分辨率分析。相比连续切片分析，同一张切片上任意标志物可以精确对位，实现真正的单细胞比较。标志物数量还可以通过更多漂白-复染轮次继续增加——上限由组织稳定性决定。

定量与统计分析

拼接配准后，用 QuPath v0.6.0 做定量荧光分析：在代表性组织区手动勾画 ROI 并在各条件下保持一致。自发荧光分析取全部通道的中位荧光强度（中位数对孤立亮结构和成像伪迹更稳健），以相对未处理对照的下降百分比表示去自发荧光效果。荧光团灭活分析取对应 Opal 通道的平均荧光强度，计算漂白前后下降百分比；时间曲线实验用归一化自动曝光时间的倒数表示剩余信号（保持在相机线性动态范围内）。统计用 GraphPad Prism 11，单因素 ANOVA + Šídák 多重比较，数据以 mean ± SD 呈现。

局限性

• 反复 HIER 损伤组织：逐步导致脱片和结构完整性丧失，染色轮次数因此受限。
• 耗时：单个荧光团一轮约 3 h；提高通量可改造为适配 Akoya 系统的自动染色机。
• 部分蛋白不耐多轮 HIER：表位稳定性下降或抗原性改变，晚轮次检测不可靠——敏感标志物必须排前，因此研究里"敏感标志物"的总数受限。
• 算力需求：高重成像数据量大，连续轮次的配准可能超出普通电脑能力（活检、组织芯片、类器官等小样本一般没问题，大切片需要强力计算资源）。

Troubleshooting

问题 1：组织脱片

• 换用粘附载玻片（阳电荷/多聚赖氨酸包被）；室温晾干后再 56 °C 长时间烤片；能不用 pH 9 就不用，改多轮 pH 6，必须用 pH 9 的抗体挪到最后并保留给严格依赖它的标志物；缩短 HIER 时间或换微波/水浴/高压锅；降低 H₂O₂ 浓度（但保证灭活效果）；漂白时给环境降温或中途暂停让灯散热。

问题 2：高背景、低信噪比（拆分时发现）

• 降一抗浓度（必要时提 Opal 浓度）改善特异结合；调整抗体-Opal 配对（Opal 480/520 与自发荧光光谱重叠，应配给信号强而清晰的标志物）；核查 inForm 拆分库；延长或增加洗涤。

问题 3：漂白无效

• 延长光照孵育；提高 H₂O₂ 浓度（如 4.5%）或加 NaOH（如 20 mM，同时盯紧组织完整性）；换光源（全光谱灯最佳，LED 优于卤素灯——光输出高、发热低，确保光源直射样本）；降一抗浓度；对难漂白荧光团缩短成像曝光时间避免信号带入下一轮；分析时加阈值去背景。

问题 4：多重染色中标志物信号弱或不均（拆分时发现）

• 按表达丰度/共定位重排抗体-Opal 配对：弱标志物配亮染料（480/520/570），强标志物配暗染料（620/690/780），共表达标志物避开相邻荧光团和相邻位置；遵循定位实验的排位结论（HIER 敏感表位靠前，反复 HIER 才暴露的表位靠后）；信号弱、点状或均匀弥漫提示一抗欠饱和——加浓度或延长时间；信号过强掩盖结构则减浓度；Opal 弱信号提到 ≥1:50，过强降到 ≤1:2000。

问题 5：相邻通道/位置出现错误信号

• 共表达标志物避免相邻荧光团（拆分不完全会串色）；共表达标志物避免相邻位置（HIER 剥离不完全会给后续通道带来假阳性）；延长 HIER 或换 HIER 方法加强剥离；做 drop-out 对照验证剥离效果——染色剥离后下一轮省去一抗只加二抗+Opal，成像时若两个荧光团都有信号说明剥离不彻底，需延长 HIER 或换方法。

问题 6：Opal 480 标志物无信号或高背景

• 拆分不完全或拆分时把正信号减掉了——在 inForm 里重调拆分设置；或把 Opal 480 改配给丰度更高、信号更清晰的标志物。

资源可用性

• 通讯作者：Meng Dong（meng.dong@ikp-stuttgart.de）；技术联系人：Elias Stahl / Yang Zhang。
• 代码：github.com/Zha2Git/Stitching_Alignment_Tool（Zenodo 存档 10.5281/zenodo.21048347）；教程视频与示例数据：cloud.uni-jena.de/s/g92RdL4ejc2YGDM。
• 未产生新的独特材料。本研究使用去标识化患者样本，经知情同意并由蒂宾根大学伦理委员会批准。