果蝇神经元 FRET 代谢传感器成像的 pH 校正方案

Protocol for pH correction of FRET-based fluorescent biosensor imaging in dissociated Drosophila neurons

Matthew S. Price, Elham Rastegari, Kartik Venkatachalam（德克萨斯大学健康科学中心休斯顿校区 McGovern 医学院）

STAR Protocols 7(3): 104802 · 2026-08-27 · DOI: 10.1016/j.xpro.2026.104802 · PMC13546833 · CC BY-NC-ND 4.0

一句话概要

胞内 pH 波动会改变荧光蛋白的发光性质，让 FRET 代谢传感器把"pH 变化"误报成"代谢物变化"。本方案用胞内 pH 指示剂 pHrodo Red AM 与 FRET 传感器（示例为乳酸传感器 Laconic）在解离培养的果蝇三龄幼虫神经元中共成像，并在每次记录末尾用一针 NH₄Cl 脉冲给每个细胞打出一段确定的 pH 响应，再用 R 脚本逐细胞做事后 pH 校正，最终得到真实反映代谢物水平的 FRET 比值。

完整使用细节请参考原始研究：Price et al., iScience 28 (2025) 113462。

亮点（Highlights）

• 提供果蝇幼虫脑解剖、解离与原代神经元培养的逐步流程；
• pHrodo 与 FRET 传感器同步成像，同时获取胞内 pH 与代谢物动态；
• 记录末尾 NH₄Cl 脉冲 + 自定义 R 脚本，实现逐细胞的 FRET 比值 pH 校正，并自动计算曲线下面积（AUC）等统计指标。

背景与创新点

荧光遗传编码传感器广泛用于监测胞内分子水平，但 pH 波动会独立于代谢物结合地改变荧光强度和能量转移效率——尤其在研究本身会扰动 pH 的通路时，pH 效应可能掩盖甚至伪造代谢动态。现有传感器成像方案普遍缺少逐细胞的 pH 校正策略。

本方案的创新在于：

1. 同步双通道设计：pHrodo（红光，561 nm 激发）与 Laconic（445 nm 激发，488/535 nm 双发射）在同一视野同时采集，逐帧对照；
2. NH₄Cl 脉冲标定：记录末尾加入 NH₄Cl，使每个细胞都产生一段可预期的快速碱化—恢复曲线，把"pH 变化对荧光的影响"变成逐细胞可量化的线性关系；
3. 自动化 R 分析：自定义脚本（GitHub 开源，Zenodo: 10.5281/zenodo.20649762）自动完成背景扣除、光漂白校正、比值计算、pH 校正与 AUC 统计。

方案用 d42-GAL4 驱动的 UAS-Laconic（乳酸传感器）优化，但兼容其他 GAL4 驱动与 pH 敏感传感器（如葡萄糖传感器 UAS-FLII12Pglu-700μδ6）。

实验总览与时间线

流程：解剖幼虫脑 → 酶解 + 吹打解离成单细胞 → ConA 包被皿铺板培养 4 天 → pHrodo 装载 30 min → 共聚焦活细胞成像（基线 6 min → 处理 6 min → NH₄Cl pH 挑战 5 min）→ R 脚本逐细胞 pH 校正 → pH 校正后的 FRET 比值与 AUC。

材料与仪器（关键资源表）

试剂配方（Materials and equipment）

① 原代神经元培养基（10 mL）

50 mL 离心管中混匀，0.45 μm 注射器滤器过滤除菌，1 mL 分装，4°C 保存 ≤8 周。

② 无钙 HL3 成像液（500 mL）

0.22 μm 真空滤器过滤除菌，4°C 保存 ≤8 周。成像当天补钙：每 40 mL 无钙 HL3 加 40 μL 2 M CaCl₂ 母液。

③ 木瓜蛋白酶解离液

先配三种母液：

终液（15 mL 管）：无钙 HL3 12 mL + 2 M CaCl₂ 母液 9 μL + 5 mM L-半胱氨酸母液 1 mL + 木瓜蛋白酶母液（5 U/mL）100 μL。0.45 μm 过滤除菌，120 μL 分装，−20°C 保存 ≤6 个月。

④ pHrodo 染色液（现配现用，约 1 mL 够 10 皿）

先把 AM 酯在 PowerLoad 里用枪头充分混匀，再加培养基混溶。用前现配，剩余弃掉；每皿用 100 μL。

分步方案

Before you begin

1. 制备 ConA 包被皿（1–2 周）

• 每 10 个成像皿：0.5 mg ConA 溶于 1 mL PBS，100 μL 分装，−20°C 保存。
• 每孔加 100 μL ConA 液，超净台开挡板敞开孵育 1 h；吸弃后开挡板晾干 1 h；盖好存于超净台内，晾干 ≥1 周（2 周效果最佳）再使用。

2. 产幼虫（2 周）

• 10–15 只处女 UAS 雌蝇 × 3–5 只 GAL4 雄蝇，标准果蝇培养基，每 2–3 天转管一次，最多转 3 管。交配瓶数按所需皿数调整。
• 示例基因型：UAS-Laconic × d42-GAL4（运动神经元乳酸成像），也可换 UAS-FLII12Pglu-700μδ6（葡萄糖）等。

3. 配培养基、无钙 HL3、木瓜蛋白酶液（见上方配方）。

4. 装软件（30 min）：安装 R 与 RStudio，下载 Lactate dynamics ratio analysis R 脚本，安装依赖库，改好脚本输入/输出路径。

合规提醒：果蝇品系操作、木瓜蛋白酶、激光显微镜及废液处理需符合所在机构的实验室安全与伦理规定。

样品制备（4 天）

1. 幼虫脑解剖（1 h）

1. 体表消毒：双凹玻片一腔盛 70% 乙醇、另一腔盛无菌蒸馏水。挑选表达 FRET 传感器的 wandering 三龄幼虫，乙醇浸 5 s 后立即转入水腔洗去残液。
2. 解剖：两腔各加 150 μL 原代神经元培养基（一腔解剖、一腔暂存脑）。体视镜下用细镊在示意的虚线后方横向剪开体壁，按箭头方向牵拉暴露脑（带成虫盘），摘除成虫盘至只剩脑叶与腹神经索，立即移入暂存腔。每皿 3 个脑（如 10 皿 30 脑）。

2. 幼虫脑解离（约 45 min）

1. 小心吸掉暂存腔的培养基（别碰散脑），立即加 100 μL 木瓜蛋白酶液。浮起的脑用无菌枪头轻轻压到液底保证酶暴露均匀。已验证每 100 μL 酶液可解离 1–30 个脑；本方案的 pHrodo 浓度按 30 脑/100 μL 出 10 皿校准。
2. 玻片放入湿盒（灭菌枪头盒底加 5 mL 高压水），25°C 酶解 30 min。
3. 吸弃酶液 → 加 100 μL 新鲜培养基洗 → 吸弃 → 再加 100 μL 新鲜培养基。
4. 用 P200（普通吸头）连脑带液吸入 1.5 mL 离心管，设定 40 μL 吹打约 5 min，至无组织团块、完全分散成单细胞。必要时台式离心机 ≤5000 rpm 短甩去泡后重悬。

3. 铺板（15 min）

• 超净台内用 23–25°C 培养基重悬神经元，调至 100 μL/皿（10 皿共 1 mL）；每次分装前吹打混匀，保证细胞均一。
• 每孔铺 100 μL 到 ConA 包被的 35 mm 玻底皿，确保液面铺满接触孔缘。湿盒内 25°C 贴壁孵育 16–24 h。

4. 培养 3 天

• 铺板次日起每天换液一次防止酵母过度生长：吸掉旧液 → 100 μL 无菌 PBS 轻柔洗去碎片与酵母 → 吸弃 → 换 100 μL 预热（23–25°C）培养基，回 25°C 湿盒。
• CRITICAL：洗涤务必轻柔，防止细胞被冲掉。 铺板第 2 天起每天镜检污染情况；少量酵母污染不影响实验。
• 铺板后第 4 天成像。

成像（当天）

5. 配成像试剂（约 30 min）

• pHrodo 染色液现配（见配方④）。
• 含钙 HL3：如 10 皿，往 40 mL 无钙 HL3 中加 40 μL 2 M CaCl₂ 母液。
• 60 mM NH₄Cl（6×）：先配 1 M 母液（0.535 g NH₄Cl 溶于 10 mL MilliQ 水，0.45 μm 除菌，4°C 存放）；取 300 μL 1 M 母液加入 5 mL 含钙 HL3。其他处理药物/代谢物同样按 6× 浓度配在 400 μL 含钙 HL3 里。

CRITICAL：本方案只验证了 Invitrogen pHrodo Red AM（P35372），未验证其他红色 pH 染料。

6. pHrodo 装载（30 min）

• 吸掉皿中旧培养基 → 立即加 100 μL pHrodo 染色液，铺满细胞 → 室温孵育 30 min → 吸弃 → 换新鲜原代培养基 → 回湿盒。

7. 配置显微镜（10 min）

• 宽场或激光扫描共聚焦，40× 油镜；视野 ≥512×512 像素；针孔全开以最大化信号。
• 通道：Laconic 激发 445 nm、发射 488 nm + 535 nm；pHrodo Red 激发 561 nm、发射 585 nm；488/535/585 三通道顺序采集。
• 不平均扫描线，dwell time 调到最低以减少光漂白。
• 五段式连续时间线：基线 6 min → 暂停 30 s → 处理 6 min → 暂停 30 s → pH 挑战 5 min。
• 选一个含 ≥20 个表达传感器的神经元的 ROI；488/535/585 三通道的激光功率与增益调到不过饱和，一旦设定，整个成像批次不得更改。

8. 时间线采集（约 20 min/实验）

1. 成像前 10 min，把每皿培养基换成 2 mL 含钙 HL3 平衡。
2. 样本上镜台，选新 ROI；有自适应对焦就打开，全程锁定焦面。
3. 开始采集，记录 6 min 基线。
4. 第一次 30 s 暂停时，小心加入 400 μL 6× 处理液（药物或代谢物）。建议用 Eppendorf Repeater E3 等电动移液器减少手动加液伪影。CRITICAL：枪头对准液面、避免吸回孔内液体，防止机械扰动 neurons 影响成像。
5. 恢复采集 6 min。
6. 第二次 30 s 暂停时加 400 μL NH₄Cl 液（终浓度 10 mM，即 7× 工作液对 10 mM），启动 pH 挑战。
7. 继续成像 5 min 监测胞内 pH 响应。
8. CRITICAL：每个处理至少 3 次生物学重复，且分布在不同实验日。

图像与数据处理

9. 图像质检（约 4 min/文件）：用 Nikon Elements 或 ImageJ/FIJI 逐帧目检所有通道。若软件对齐无法纠正明显的失焦或视野漂移，整皿剔除。

10. 数据提取（约 5 min/图像）

• 在表达传感器的神经元胞体周围画 ROI；成像中消失或任何时刻接触到漂浮碎片的细胞不画。
• 另设一个无细胞区域的背景 ROI。
• 用 ROI mask 把每帧对齐到第一帧，校正皿体物理位移。
• 导出 CSV：第一列实验事件编号，第二列时间，其余列各通道发射强度。CRITICAL：pHrodo 的 ROI 强度文件文件名必须含 "pHrodo"，分析脚本靠文件名区分数据文件。

11. R 脚本处理（约 10 min/组实验）：CSV 放入脚本的 input 目录，运行 "Laconic analysis with pH correction"。输出两类文件：

• normalized_laconic_ratios_pH_corrected_mean_SEM_[原文件名]：pH 校正后的时间序列比值（含均值 ± SEM），用于画代谢动态曲线；
• AUC_per_time_pH_corrected_[原文件名]：pH 校正后的曲线下面积，用于处理组间统计比较。

定量与统计分析原理

R 脚本的处理链条：

1. 背景扣除：每个神经元 ROI 强度减去无细胞背景 ROI 强度；
2. 光漂白检测与校正：检查校正后强度的漂白趋势并修正；
3. FRET 比值：漂白校正后算比值（Laconic = mTFP/Venus），并用处理前 6 min 基线均值归一化；
4. 基线漂移拟合：归一化比值先对预处理基线拟指数曲线（基线设为 1），消除 pH 校正前的漂移与弯曲；
5. 逐细胞 pH 校正：NH₄Cl 脉冲在记录末尾给出确定的胞内 pH 变化；pHrodo 与传感器信号对 NH₄Cl 的响应在单细胞水平呈线性关系，脚本据此剔除纯由 pH 变化引起的比值波动；
6. AUC 与反事实基线：对每条 trace 计算从首次加药到最后一个 NH₄Cl 前时间点的 AUC；用 CausalImpact 包外推"未处理"的反事实基线，两者差值按处理后窗口时长归一化，即为比值的积分变化量。

预期结果

• 成像应得到稳定的基线 FRET 比值和对处理的可重复响应；
• NH₄Cl 脉冲后 pHrodo 信号应出现快速碱化随后恢复的特征曲线——这是每个细胞 pH 响应标定的关键；
• 未经校正时，pH 波动会让 Laconic 比值"假变动"；跑完 pH 校正后，这些假信号被抹平，剩下的才是真实代谢物变化（原文 Figure 5 给出示范：pH 校正前后 NH₄Cl 引起的比值变化被明显消除）；
• 脚本输出 pH 校正比值时间序列与 AUC 两套文件，可直接用于画图与统计。

局限性

1. 方案在三龄幼虫解离神经元上优化，其他发育阶段或动物模型需另行优化；
2. pH 校正的成败取决于 pHrodo 装载质量——信号弱或不均的神经元无法可靠校正，可能需要剔除；
3. 加药时的机械扰动会引入伪影，掩盖真实代谢响应；
4. FRET 传感器表达量低时信噪比差，且事后处理无法弥补采集端的质量缺陷；
5. 采样率过低会降低时间分辨率，漏掉快速或瞬时的代谢事件。

Troubleshooting

资源与数据

• 分析代码开源：GitHub - kvenkatachalam-lab/Price_and_Rastegari_2026（Zenodo: 10.5281/zenodo.20649762）；
• 补充材料（Table S1–S9：输入/输出 CSV 样例、解剖方法视频 S1）见原文 DOI 页面；
• 通讯作者：Kartik Venkatachalam（kartik.venkatachalam@uth.tmc.edu）；技术联系：Matthew S. Price / Elham Rastegari。