无内毒素人源重组 Tau 蛋白的高效纯化方案

Protocol for efficient purification of endotoxin-free human recombinant tau protein

Maria Kreger Karabova, Ana del Ser-Badia, William S. James, Sally A. Cowley（牛津大学 Sir William Dunn 病理学系 · James and Lillian Martin 干细胞研究中心）

STAR Protocols · 2026-08-27 · DOI: 10.1016/j.xpro.2026.104800 · PMC13546840 · 质粒已存 Addgene（Cat#249347）

一句话背景

研究小胶质细胞对 tau 蛋白的应答时，最大陷阱是内毒素（LPS）污染：大肠杆菌表达体系里的 LPS 一旦释放，会靠强静电作用牢牢"挂"在净正电荷的 tau 上，哪怕痕量也能通过 CD14–TLR4–MD2 通路引爆小胶质细胞的炎症反应，让实验结果分不清是 tau 的效应还是内毒素的干扰。这个方案把去内毒素直接整合进纯化流程，在镍柱上用 Triton X-114 原位洗脱内毒素，最终产物在 1 μg/mL 工作浓度下内毒素 ≤0.01 EU/mL。

方案亮点（Innovation）

• 柱上除热原：Ni-NTA 捕获蛋白后，立即用含 0.1% Triton X-114 的缓冲液在柱上洗涤（≥50 个柱体积），利用 Triton X-114 的相分离特性把内毒素从 tau 上解离带走——比纯化后反复去垢剂萃取更省力、回收率更高；
• 6xHis-SUMO3 标签 + SENP2 酶切：SUMO3 减少蛋白水解降解，SENP2 切割得到天然 N 端 tau，避免 TEV 酶切残留额外氨基酸；
• CIEX 阳离子交换 + 高容量除内毒素树脂双重保险：进一步提纯并清除残留内毒素；
• 附带肝素诱导聚合流程：4:1 tau:heparin 摩尔比、37°C 振荡 11 天产出可播种 tau 原纤维（PFF），TEM + FRET 生物传感器双重验证；
• 流程可推广到其他 tau 亚型及其他净正电荷、易染内毒素的重组蛋白。

关键资源表（节选）

完整清单见原文 Key Resources Table。另需 LC-MS 平台（或送质谱核心 facility）在下游应用前核实蛋白分子量与纯度。⚠️ 所有纯化储液/缓冲液 4°C 配制、调 pH、保存；纯化缓冲液当天现配；0.2 μm 抽滤除菌并 4°C 脱气。BME 有毒易燃，通风橱内操作；咪唑有腐蚀性和生殖毒性。

试剂配方（按 3 L 菌液规模）

① Tau 表达

② Tau 纯化缓冲液

③ 残留内毒素去除（生物安全柜内、当天现配，均 0.22 μm 过滤）

④ 肝素诱导聚合

肝素储液（700 μM，1 mL）：12.6 mg 溶于 WFI，0.22 μm 过滤，现配现用。⚠️ 肝素分子量批间波动（通常 15–19 kDa），按实际分子量换算用量；原文批次为 18 kDa。

分步方案

第一阶段：大肠杆菌表达（3 天）

1. 转化 BL21(DE3)：感受态冰上融 15 min → 15 ng 质粒加入 50 μL 菌悬液，轻弹混匀（勿涡旋）→ 冰上 30 min → 42°C 热激 30 s → 回冰 5 min → 加 450 μL S.O.C.，37°C 180 rpm 复苏 1 h → 涂 50 μL 于含 50 μg/mL 卡那霉素 LB 平板，37°C 14–16 h。⏸ 平板可 4°C 存，但表达建议用新鲜克隆。
2. 种子菌：挑单克隆入 40 mL LB + 卡那霉素（250 mL 瓶），共 3 瓶；37°C、180 rpm 培养 14–16 h。此时可留甘油菌（菌液:50% 甘油 = 1:1，−80°C 存 5 年）。
3. 扩大培养：每种子菌转入 900 mL TB + 100 mL 10× TB 盐 + 卡那霉素的 2 L 瓶，37°C、200 rpm 培养。
4. 诱导：每 30 min 测 OD600，达 0.5–0.7（约 2–3 h）时加 5 mL 100 mM IPTG（终 0.5 mM）。先 37°C、225 rpm 诱导 1 h，再 25°C、200 rpm 继续 14–16 h。
5. 收菌：5,000 ×g、4°C 离心 30 min。来不及离心可冰上暂放数小时，切勿冷冻。每升原菌液沉淀用 25 mL 新鲜预冷裂解液重悬——务必彻底无团块（防堵匀浆器），全程冰上。⏸ 重悬后菌体 −80°C 可存 4 周，或步骤澄清后再存——两个暂停点只能选其一。

第二阶段：细菌裂解（4–5 h）

6. 菌悬液冰上融化；French Press 匀浆：15 kpsi，4–5 个循环至完全破碎（4°C 循环水保温；小规模可超声）。
7. 裂解液入 50 mL LoBind 管，4,500 ×g、4°C 离心 1 h 去碎片；上清转入新管。⏸ 上清可 −80°C 存 1 周。
8. 热变性除杂：70°C 水浴 10 min（先稍松盖防胀压），室温冷却 10–15 min；再次 4,500 ×g、4°C 离心 1 h。
9. 上清经 0.45 μm 滤器过滤合并，置冰上进 IMAC；留 20 μL 做 SDS-PAGE。

第三阶段：无内毒素纯化（2 天，全程 4°C）

（A）IMAC + 柱上 Triton X-114 除内毒素（HisTrap HP 5 mL，5 mL/min）

10. 5 CV ddH₂O 洗柱 → 5 CV A1 平衡 → 上样（约 100–150 mL；无空气传感器务必固定上样体积）→ 留 20 μL 流穿 → ≥50 CV A2（0.1% Triton X-114）洗柱（除内毒素关键步骤） → 20 CV A1 洗去残留去垢剂 → 0–100% B 线性梯度 33 CV + 100% B 6 CV，5 mL/管收集 → 清洗封柱（每 2–3 次用 60 CV 1 M NaOH 深度清洗）。
11. SDS-PAGE（8%–16% Tris-Glycine + SimplyBlue）：融合蛋白（约 75 kDa）主要在 10–16 管。合并含 tau 峰管。省时技巧：染液微波高火 20–30 s（勿沸腾）再摇 15 min。
12. 粗测浓度：按洗脱梯度算合并液平均咪唑浓度（原文示例 181.8 mM），用 B 液配同浓度咪唑空白，NanoDrop 粗测；预期 1–1.1 mg/mL（可用 Bradford 替代）。

（B）SENP2 切标签 + 过夜透析

13. 按 SENP2:tau = 1:100（w/w）加 SENP2（厂商推荐 1:50，实测 1:100 已切透），冰上轻柔混匀。
14. 切标签与透析同步过夜：SnakeSkin 透析袋（3.5 kDa）剪约 1 cm/mL + 余量，ddH₂O 泡 10–15 min；灌入混合液（留 0.5 cm 顶部空间）两端夹紧；放入 4.5 L 透析缓冲液（约 100 倍样品体积）；⚠️ 系浮漂防搅拌子搅破袋子；铝箔避光 4°C 缓慢搅拌过夜。
15. IMAC rebind（换专用柱）去未切蛋白与残余 SENP2：5 CV ddH₂O → 5 CV Rebind C 平衡 → 上样约 35 mL → 收流穿（切后 tau 理论上在此）→ 10 CV C 洗柱 → 0–20% D 梯度 30 CV + 45% D 5 CV + 100% D 5 CV，5 mL/管。???? 实践中部分切后 tau 会非特异吸附在柱上（低盐 + tau 固有无序特性），必须用咪唑梯度回收。合并含 tau 峰管（约 55–60 kDa，原文 34–43 管）。
16. 用 CIEX E 稀释合并液，把咪唑降到 15–30 mM——决定 tau 能否结合 CIEX 柱的平衡点（太高不结合、稀释太狠上样时间暴增）。

（C）CIEX 阳离子交换（HiTrap Capto S 5 mL，5 mL/min）

17. 5 CV ddH₂O → 5 CV E 平衡 → 上样 → 收流穿 → 6 CV E 洗柱 → 0–100% F 梯度 30 CV + 100% F 5 CV，5 mL/管 → 清洗封柱。???? 原理：2N4R tau 理论 pI ≈8.2，pH 7.1 下带净正电，结合带负电树脂。
18. SDS-PAGE 后合并含 tau 单体峰管（约 60 kDa），留 20 μL。⏸ 可 4°C 存过夜。

第四阶段：浓缩、残留内毒素去除与质检（1–2 天）

19. 浓缩：10K MWCO PES 浓缩器 ×3（50 mL 均分），4,000 ×g、4°C，浓缩至 2–3 mL（约 30–45 min）。⚠️ 勿过度浓缩——体积太小时 tau 聚集或粘膜；膜用 0.5–1 mL 洗脱液冲洗并回收入样（终约 2–2.5 mL）。
20. 残留内毒素去除（安全柜内）：Pierce 高容量除内毒素 Spin 柱——树脂用 3.5 mL 0.2 N NaOH/95% 乙醇室温滚轴再生 2 h → 与浓缩 tau 室温滚轴共孵育 2 h（比厂商推荐更久）→ 500 ×g 离心 1 min 收样（约 2.5 mL）→ 0.22 μm 过滤。⏸ 终产物 4°C 可存 1 天。
21. 定量与质检：BCA 测浓度（3 L 预期约 3.5 mg）；LAL 显色法测内毒素——0.01–0.1 EU/mL 低浓度标准曲线、样品 WFI 25 倍稀释三复孔；目标：工作浓度（1 μg/mL tau）下 ≤0.01 EU/mL。
22. 分装与保存：LC-MS 验证 10 μL/管、聚纤维 500 μL/管、iPSC-小胶质细胞实验 20 μL/管；液氮速冻 −80°C（实测可存 1 年）。

第五阶段：肝素诱导 tau 体外聚合（11 天）

23. 冰上融化 500 μL 单体 tau；安全柜内配聚合体系：按浓度算 tau 摩尔数 → 加肝素储液至 tau:heparin = 4:1（摩尔比）（肝素现配 + 过滤，摩尔比务必精确）→ 加 1 μL 1 M DTT（终 2 mM）→ 轻柔混匀。
24. 封口膜封管，37°C、250 rpm 振荡 11 天。替代：Thermomixer C 700 rpm（按轨道直径换算 r₂ = r₁×√(D₁/D₂)，Innova 44 D=25 mm、Thermomixer C D=3 mm）；换其他摇床建议实测验证。
25. 第 11 天质检：BCA 浓度；负染 TEM（样品 1:20 稀释，10 μL 滴新辉光放电 300 目碳膜铜网 2 min，2% 醋酸铀负染 20 s）；FRET biosensor 播种实验——Tau RD P301S 细胞 25,000/孔铺 96 孔板，Lipofectamine 2000 转染 50 nM 纤维（2× 纤维液 100 nM 10 μL/孔 + 转染液 1 μL Lipo2000 + 9 μL Opti-MEM/孔，等体积混合室温 20 min，每孔加 20 μL 不换液；阴性对照 = 10 μL 转染液 + 10 μL Opti-MEM；3 技术重复）；48 h 后 EVOS 成像观察包涵体；BD Fortessa ×20 流式 405 nm 激发、CFP 405/50 + FRET 525/50（⚠️ 488 nm 激光务必关闭），FlowJo v10 分析。纤维液氮速冻 −80°C 可存 1 年。

预期结果

• 3 L 菌液 IMAC 得 35–40 mg 融合蛋白；SENP2 1:100 即切透；CIEX 后终产量 3–4 mg、浓度 1.5–1.6 mg/mL（仍可能有痕量截短片段，tau 极易截短但已大幅减少）；
• 内毒素控制是核心成果：原液约 0.5–2.5 EU/mL，稀释到工作浓度后 ≤0.01 EU/mL，对 TLR4 激活可忽略；
• 纯化单体保留肝素诱导聚合能力，TEM 可见纤维、FRET biosensor 播种阳性（P<0.0001）；纤维形貌与播种活性批间有波动，每批次做结构与功能双重 QC。

局限性

1. 批间波动：产量、纯度、内毒素水平都可能有差异（tau 固有无序特性导致层析非特异互作），必须严格 QC；
2. CIEX 结合不完全：IMAC 残留咪唑、pH 与离子强度影响结合，部分蛋白可能流失于流穿液；
3. 体外纤维 ≠ 体内聚集体：肝素诱导纤维比脑源 tau 结构更不均一、缺少疾病相关翻译后修饰与辅因子、播种能力与细胞效应有差异；需更高生理相关性时可考虑用疾病来源提取物播种重组 tau。

Troubleshooting

资源与数据

• 通讯作者：Sally A. Cowley（sally.cowley@path.ox.ac.uk）；技术联系：Maria Kreger Karabova；
• 质粒 pETM11-Sumo3-TauWT2N4R 已存 Addgene（Cat#249347）；本文数据均含于论文正文。