枯草芽孢杆菌噬菌体感染的单细胞活成像优化方案

Optimized protocol for live imaging of Bacillus subtilis phage infection at a single-cell resolution

Hannah R. Bonham, Virginie Grosboillot, Valentina A. Floccari, Iztok Dogša, Anna Dragoš（斯洛文尼亚卢布尔雅那大学生物技术学院微生物学系）

STAR Protocols · 2026-08-26 · DOI: 10.1016/j.xpro.2026.104805 · PMC13543884 · 原始数据已存 Zenodo

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一句话背景

想亲眼看着噬菌体"吃掉"细菌？难点在于：固定或物理 immobilization 会抑制细菌生长，而液体培养又难以持续对焦同一批细胞。这个方案用 Gene Frame 贴框琼脂糖垫片 + SYBR Gold 活染噬菌体，实现了不固定、不 immobilization，在固体培养基上同时追踪噬菌体颗粒和细菌的单细胞延时成像，连续记录 16 小时的"感染—裂解"全过程。

方案总览

• 准备 1：Gene Frame 贴框琼脂糖垫片制备（LB 或 M9 两种培养基，可加膜染料 FM 4-64）
• 准备 2：SYBR Gold 染色噬菌体颗粒（DNase I 去宿主 DNA + 超滤管洗涤 16 次）
• 准备 3：细菌培养至 OD₆₀₀=0.15，与噬菌体同垫共接种，延时成像约 16 h
• 准备 4：Fiji 图像后处理——去背景荧光 + 算串扰系数 k 去通道串扰

关键资源

类别	试剂 / 资源	来源	编号
化学品	LB 肉汤	condalab	1231.00
	琼脂糖（凝胶化温度 36°C）	Sigma Aldrich	A9539-250G
	FM™ 4-64 膜染料	ThermoFisher	T13320
	DNase I，无 RNase（1 U/μL）	ThermoFisher	EN0521
	SYBR™ Gold 核酸凝胶染料	ThermoFisher	S11494
耗材	Gene Frame 贴框，65 μL（1.5×1.6 cm） ⚠ 2025 年底已停产	ThermoFisher	AB0576
	Amicon® Ultra 超滤管，100 kDa	Sigma Aldrich	UFC9100
	ibidi 聚合物盖玻片	ibidi	10813
菌/毒株	B. subtilis P9_B1 amyE::mKate（spec）	Dragoš 等	N/A
	Bacillus phage Nf（裂解性）	Bacillus Genetic Stock Center	N/A
软件	Fiji ImageJ 1.54p	NIH	imagej.nih.gov/ij
	ZEISS Elyra 7 + ZEN lite（成像）	Carl Zeiss	—

贴框停产品替代：GRACE BIO-LABS 的 SecureSeal™ Frame and Cover，或 SUNJin Lab 的 iSpacer 贴框。

试剂配方

5× M9 盐溶液（100 mL）

试剂	终浓度	用量
Na₂HPO₄（磷酸氢二钠）	211 mM	3.0 g
KH₂PO₄（磷酸二氢钾）	110 mM	1.5 g
NaCl	42.8 mM	0.25 g
NH₄Cl（氯化铵）	93.5 mM	0.5 g
去离子水	—	定容至 100 mL

保存：4°C 或室温，最长 3 个月。安全提示：NH₄Cl 急性毒性 4 类（吞咽有害）+ 眼刺激 2 类，称量须戴 N95、护目镜、手套和实验服。

M9 培养基（100 mL，用前现配）

77.79 mL 无菌 MilliQ 水 + 20 mL 无菌 5× M9 盐溶液 + 200 μL 无菌 1 M MgSO₄ + 2 mL 无菌 20% 葡萄糖 + 10 μL 无菌 1 M CaCl₂。

SM 缓冲液（500 mL）

试剂	终浓度	用量
NaCl	100 mM	2.92 g
Tris-HCl	50 mM	3.94 g
MgSO₄·7H₂O	8.0 mM	0.98 g
去离子水	—	定容至 500 mL

配制：先加约 300 mL ddH₂O 溶解试剂，定容后调 pH 7.5，0.22 μm 过滤除菌。保存：4°C 或室温，最长 6 个月。

准备 1：琼脂糖垫片制备（Gene Frame 贴框法）

耗时：约 30 min–2 h（取决于灭菌方式）

步骤 1 · 制备固体培养基

• LB-1.5% 琼脂糖：1.5 g 琼脂糖 + 100 mL LB，高压灭菌，60°C 保温防凝。灭菌后立即制垫，培养基存放不超过 2 天。
• M9-1.5% 琼脂糖：1.5 g 琼脂糖 + 100 mL 无菌 M9，微波融化，60°C 保温。

培养基怎么选：LB 背景荧光高（尤其 GFP 波段）；M9 背景干净但步骤多、污染风险高，必须现配现用。选琼脂糖不选琼脂：纯度高、质地细、光学表面更均匀。

步骤 2 · 贴框定位

• 70% 乙醇 + 纸巾彻底清洁载玻片（去油污、保无菌）。
• 贴框夹在两层塑料片间：撕掉中心无方孔那侧，另一层保留。框规格 16×15 mm、厚 0.25 mm、容积 65 μL。
• 粘面朝上放载玻片中央，隔着塑料片按压密封；第二层保护膜先不撕。

步骤 3 · 灌胶

• 金属浴预热 Eppendorf 管 60°C（约 10 min）。
• 加 150 μL 琼脂糖培养基（实际只用 100 μL，多配 1.5 倍防气泡）。
• 吸 100 μL 加到贴框中央，吸头留少量防气泡。
• 立即盖上无菌空载玻片——动作必须快，琼脂糖一旦凝固就会压坏垫片；凝固太快可升温或 30°C 预热载玻片。液体铺满并溢出属预期。
• 静置 20 min 凝固（低熔点琼脂糖 5–10 min 即可）。光敏试剂全程避光、无菌操作。

步骤 4 · 储存

• 两片载玻片保持贴合一起拿起，铝箔仔细包裹后 4°C 储存。
• LB / M9 垫片 4°C 可存 8 周（建议自行验证）；含染料垫片储存期缩短。用前取下上层压片。

步骤 5（可选）· 含 FM 4-64 的垫片

琼脂糖培养基入金属浴后加 FM 4-64 至终浓度 1 μg/μL。FM 4-64 结合细菌膜磷脂双分子层，红荧光（激发 515–530 nm / 发射 640–660 nm）显示细胞膜。干燥过程铝箔避光。

准备 2：噬菌体颗粒染色

耗时：18 h（含 12 h 过夜）；对 Bacillus phage Nf 用 SYBR Gold 优化。

步骤 6 · DNase I 去宿主 DNA

• 1 mL 噬菌体裂解液（开发用 9×10⁸ PFU/mL）+ 111 μL 10× DNase I 缓冲液（终 1×）+ 20 μL DNase I（1 U/μL），轻混匀，37°C 1 h。
• 目的：清除裂解后游离基因组 DNA。首次操作设对照确认噬菌体活性；染料不结合 DNA 可跳过。
• 无需灭活 DNase I——已验证残留 DNase 不影响染料结合和噬菌体功能。

步骤 7 · SYBR Gold 染色与洗涤

• 加 1.2 μL SYBR Gold（1000× 储液，终 1×），颠倒 5 次，4°C 避光 14–16 h。
• 次日样品、超滤管（Amicon® Ultra 100 kDa）、SM 缓冲液全部置冰。
• 样品转入上腔 + 4 mL SM 缓冲液，4°C、3200 ×g、1 min 离心。
• 关键：上腔体积不得低于 1.5 mL——滤干会毁样品，全程监控体积。
• 每次补 4 mL 新鲜 SM，重复离心共 16 次，尽量去净游离染料、压低背景。
• 最后离心浓缩至 1 mL，沿滤膜壁吹打 5 次回收黏附噬菌体，转入避光管 4°C 保存。
• 关键：务必加做噬菌斑试验确认感染滴度——Nf 不受染色流程影响，其他噬菌体不一定。

准备 3：细菌培养与共接种

耗时：约 5–6 h。建议荧光组合发射光谱不重叠（本方案：组成性 mKate 细菌 + SYBR Gold 裂解性噬菌体）。

步骤 8 · 第 1 天：起始培养

• −80°C 甘油菌直接接种 5 mL LB 试管（枯草芽孢杆菌突变快，直接接种；低突变菌种建议先划线挑克隆）。
• 37°C、220 rpm、14–16 h。

步骤 9 · 第 2 天：转接、上垫、共接种

• 1:100 转接新鲜培养基，37°C、220 rpm，约 2–2.5 h 达 OD₆₀₀=0.4（目标 0.4–0.6）。
• 达目标 OD 前 ≥2 h，取出储存垫片在成像温度回温（保持铝箔包裹，防冷凝、护细胞）。
• OD₆₀₀≈0.4 时稀释至 OD₆₀₀=0.15（延时成像最佳起始密度）。所需菌液体积 x（μL）= 1000 ÷ 稀释倍数。
• 铝箔撕开后水平滑离上层压片（垂直掀会把垫片带起来）。无菌操作。
• 擦净框面多余琼脂糖，撕掉框顶部保护膜；无菌处晾干 7–10 min（至少 7 min，防盖片后水汽积聚）。
• 垫片一侧点 0.5 μL 染色噬菌体，晾 2 min；另一半点 0.5 μL 菌液，中间轻微重叠，晾至全干。噬菌体按与细菌 1:1 体积点样；MOI 按噬菌体类型单独优化。
• 盖玻片像"贴手机膜"：先落一边再落另一边，保护面朝下，沿框远缘轻压密封；盖片与垫片间不能有空气隙。

参考成像参数（ZEISS Elyra 7）

参数	设置
绿通道（噬菌体）	488 nm 激光 100 mW，7% 功率 + 495–550 nm 带通
红通道（细菌 mKate）	561 nm 激光 100 mW，7% 功率 + 570–620 nm 带通 + 655 nm 长通
物镜 / 相机	Plan-Apochromat 63×/1.4 NA 油镜 DIC；双单色相机 integration，50 ms/通道，1×1 binning，16-bit，1280×1280
像素尺寸 / 视野	96.8×96.8 nm（FOV 约 124×124 μm）
时间序列	320 帧 × 3 min 间隔 ≈ 连续 16 h，6 个台位，孵育仓 32°C

准备 4：图像后处理（Fiji）

原始 ∗.czi，Fiji ImageJ v1.54p；示例文件见 Zenodo。需两组对照（与延时样本同参数、红绿双通道）：Bacteria_only（mKate 菌无噬菌体）和 Phages_only（染色噬菌体无菌）。

步骤 12 · 定背景值

• Fiji 打开 Bacteria_only_Red 和 Phage_only_Green → Analyze → Tools → ROI Manager。
• 矩形工具在无物体背景区画 5 个同尺寸大 ROI（避开图像边缘和照明不均）→ Analyze → Measure（M）。
• 取均值：BG_G 来自 Phage_only_Green，BG_R 来自 Bacteria_only_Red。
• 目标不是把背景降到 0，而是降到低水平（约 20）。

步骤 13 · 去背景

• .czi 打开为红绿两 stack（若是 hyperstack：转 32-bit → Split Channels）；测量都在第一帧做（假设背景不随时间变）。
• 两 stack 转 32-bit，各存副本（命名：BS=已去背景，CTS=已去串扰）。
• Process → Math → Subtract → BG_G / BG_R，Process all slices，得 G_stack_BS 与 R_stack_BS。
• 关键：背景只保留 15–25——噬菌体信号太弱，减过头信号就没了。红通道串扰极小，去背景即可，无需再扣。

步骤 14 · 算串扰系数 k，去串扰

绿通道串扰与 mKate 物体（细菌）空间相关，不是均匀分布——用"只有串扰存在"位置的红绿值算系数 k，再用 k 缩放红通道从绿通道减去：

• 在 G_stack_BS 第一帧选 10 个同尺寸 ROI：5 个背景区 + 5 个细菌重叠区（避开噬菌体，尽量靠图像中心），保存位置后在 R_stack_BS 同位置测量。
• 分别求均值：G_bacteria、G_background、R_bacteria、R_background（背景仍保持 15–25）。

k = (G_bacteria − G_background) ÷ (R_bacteria − R_background)

• R_stack_BS → Process → Math → Multiply → k（Process all slices）→ R_scale_k。
• Process → Image Calculator：G_stack_BS − R_scale_k（Process all slices）→ G_stack_BS_CTS。
• 验证：把算 k 的 ROI 放回减除后的绿通道——减除前细菌处信号恒高于背景，减除后两者应几乎一致。
• 最后合并两通道为 hyperstack，可加时间/比例尺、导出视频。

预期结果

• 垫片：完全凝固、平滑均匀、铺满贴框方孔；无气泡、褶皱、灰尘（否则聚合物盖片会翘曲）。
• 染色噬菌体：1 mL 浓度与工作储液相当；染色洗涤和 DNase 处理均不损失 Nf 感染性；4°C 避光 1 周内保持荧光（Nf 特异，其他噬菌体需自测）。
• 成像：双通道叠加的 16 h 延时序列，能看清细菌生长→感染→裂解全过程；采集参数需在信号强度、光漂白、光毒性、时间分辨率之间平衡。
• 后处理：去背景和串扰后 SYBR Gold 信号定位更准，感染动力学解读更可靠。

局限性

• Sybr Gold 染色噬菌体信号很弱（<300 a.u. vs mKate >1000 a.u.），且噬菌体不停移出焦平面，观察难度大。
• mKate 激发光谱宽（延伸到约 442 nm），与 488 nm 激光小幅重叠，产生红→绿通道串扰；用无荧光基因的同株菌排除了自荧光干扰。
• 调亮度/对比度只能降低背景观感，不能校正串扰，还可能削弱真实噬菌体信号——必须后处理扣除；且因噬菌体信号弱，校正尺度只能保守宽松。

问题排查（Troubleshooting）

问题	原因与对策
① 延时中垫片移动、收缩、起泡、冷凝	垫片完整封入贴框 + 盖片通常即可；多练盖片手法防气泡；可选把琼脂糖提到 2%（开发未验证）
② 背景荧光高、噬菌体对比度差、假阳性	游离染料残留或染料错配结合；新染料先做阴性对照与比较样品，确认游离染料低、只结合目标
③ 噬菌体有荧光但宿主不裂解	染料/标签可能封了噬菌体吸附受体；换未知染料或新标记必做噬菌斑试验确认感染力
④ 串扰减除后出现黑斑/大负值	减过头了，多为 R_scale_k 图像生成有误，检查 k 计算与 ROI 选择
⑤ 视野内细胞不长，周围正常	激光光毒性；先降功率再调曝光；多选几个位置兜底

资源与联系

• 通讯作者：Anna Dragoš（anna.dragos@bf.uni-lj.si）；技术联系：Hannah R. Bonham（hannah.bonham@bf.uni-lj.si）
• 原始数据：zenodo.org/records/18165781
• 资助：ERC PHAGECONTROL（101041421）、ERA Fellowship Phage_Attach（101244217）、斯洛文尼亚 ARIS P4-0116