PDX 肿瘤细胞表面蛋白的 N-糖蛋白组富集：在体内看清癌细胞的"外套"

Protocol for N-glycoproteomic enrichment of cancer cell-surface proteins in patient-derived xenografts

Konrad Celejewski, Meinusha Govindarajan, Matthew Waas, Thomas Kislinger（加拿大多伦多大学医学生物物理系 · 玛格丽特公主癌症中心 / 大学健康网络）

STAR Protocols · 2026-08-25 · DOI: 10.1016/j.xpro.2026.104799 · PMC13543893 · PMID 42647170

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为什么值得做

细胞表面蛋白（surfaceome）是最有价值的药物靶点与生物标志物库，但在常规质谱蛋白组数据里长期"隐身"——它们疏水、丰度低，容易被高丰度胞内蛋白淹没。本方案的核心思路有两层：

• 糖链抓表面蛋白：分泌通路里的蛋白超过 80% 都带 N-糖基化（Asn-X-Ser/Thr/Cys 序列子，X≠Pro）。用高碘酸钠氧化糖链邻位二醇生成醛基，再与酰肼树脂共价偶联，把 N-糖基化肽段"钉"在珠子上——非糖肽全部洗掉，留下来的基本就是表面/分泌蛋白。
• PDX 提供物种拆分：人肿瘤移植到免疫缺陷小鼠后，癌细胞是人源、肿瘤微环境是鼠源。搜库时用人+鼠拼接数据库，肽段按"人特有 / 鼠特有 / 人鼠共有"分组，弃掉共有肽段，就能在体内把癌细胞自身的表面蛋白组从基质污染中剥离出来——这是细胞系和患者组织都做不到的。

创新点：改进的酰肼富集流程（SP3 消化提升膜蛋白溶解、硫代硫酸钠淬灭防止糖链过氧化、酵母转化酶 SUC2 内标监控技术变异），输入量可低至 100 μg，一批可做 20 个样本；除 MS 上机与搜库外全程约 4 天。

关键资源

试剂/设备	来源	货号
UltraLink 酰肼树脂	Thermo Scientific	53149
N-糖苷酶 F（PNGase F）	Roche	06538355103
Sera-Mag 羧基修饰磁珠（SpeedBeads）	Cytiva	45152105050250
Trypsin/Lys-C 混合酶（MS 级）	Promega	V5071
酵母转化酶（S. cerevisiae）	Sigma-Aldrich	I4504
碘乙酰胺（IAA）/ 二硫苏糖醇（DTT）	Sigma-Aldrich / Bioshop	I6125 / 3483-12-3
Pierce BCA 蛋白定量试剂盒	Thermo Scientific	23227
2x iRT 保留时间标准肽	Biognosys	Ki-3002-2
cryoPREP CP03 冷冻粉碎器 + TT05M 冻组织管	Covaris	500049 / 520140
超声仪 UP200St（含 VialTweeter）	Hielscher	—
SpeedVac 真空浓缩仪 SC250EXP	Thermo Scientific	—
Empore C18 SPE 盘（自装 StageTip）	Affinisep	SPE-Disks-Bio-C18
Vac-Man 真空 manifold + 三通阀 + Mobicol + 注射器	Promega / Marvelgent / Boca Scientific	A7231 等
Orbitrap Eclipse 质谱 + Neo Vanquish LC	Thermo Scientific	—
搜库软件	MaxQuant v2.4.2（或 MSFragger / Mascot / Comet 等）	—
蛋白序列库	UniProt 人+鼠拼接库（2022-04；67,858 条），须加入 SUC2 与 iRT 序列	—

数据：原始质谱数据 MASSive #MSV000096571；处理后数据见 kislingerlab 的 glycoPDXplorer 在线工具。

试剂配方（Materials and equipment）

关键：所有 1.5/2.0 mL 离心管一律用 Protein LoBind 管。质谱怕污染——全程戴手套；玻璃器皿只用 HPLC 级水和乙腈冲洗，严禁洗洁精（会带来聚合物污染）。偏高碘酸钠与 TFA 有强腐蚀/氧化性，注意防护。

裂解液（可 22°C 存放，共 10 mL）

试剂	终浓度	体积
500 mM HEPES（NaOH 调 pH 8.0）	100 mM	2 mL
10% SDS	1%	1 mL
10% Triton X-100	0.5%	0.5 mL
10% Tween-20	0.5%	0.5 mL
10% NP-40	0.5%	0.5 mL
HPLC 级水	—	补至 10 mL

其余配方

试剂	配制	储存要求
酵母转化酶 SUC2 母液（1 pmol/μL）	SUC2 2.7 mg + 水至 10 mL	分装 −20°C
碘乙酰胺 IAA（0.5 M）	0.020 g + 水 216.2 μL	现配现用、避光、不储存
碳酸氢铵 ABC（0.1 M，pH 8）	3.955 g + 水定容 500 mL	现配现用
Trypsin/Lys-C 母液（1 μg/μL）	冻干酶 100 μg + 复溶缓冲液 100 μL	分装 −20°C
偶联缓冲液（pH 5.5）	醋酸钠 4.102 g（0.1 M）+ NaCl 4.383 g（0.15 M），醋酸调 pH 5.5，定容 500 mL	现配现用；必须用校准 pH 计调 pH
偏高碘酸钠（200 mM）	8.5 mg + 水 200 μL	现配、棕色瓶避光、不储存
硫代硫酸钠（200 mM）	6.3 mg + 水 200 μL	现配现用
氯化钠（1.5 M）	4.38 g + 水至 50 mL	22°C，一个月内用完
80% 乙腈	ACN 40 mL + 水 10 mL	现配现用
80% 乙腈/0.1% TFA	ACN 40 mL + TFA 50 μL + 水 9.95 mL	现配现用；TFA 在通风橱内转移

分步方案

第 1 步 · 样品裂解与蛋白定量（2–4 h）

1. 新鲜冻存 PDX 肿瘤（约 1 cm³）用冷冻粉碎器干法磨成粉末（其他匀浆方式亦可）。
2. 粉末转入含 1 mL 裂解液的新管，涡旋。关键：必须用含去垢剂的裂解液——无去垢剂裂解膜蛋白溶不出，需要更多起始材料。
3. 95°C 加热 5 min。暂停点：液氮速冻后 −80°C 可存 1 年。
4. 块状脉冲超声 5–10 次、每次 10 s。关键：每 5 次脉冲之间冰上冷却，否则超声块过热损坏管子。（UP200St：功率 40 W、循环 100%、振幅 65%。）
5. 乙醇-干冰浴（约 −75°C）与 60°C 水浴反复冻融 4 次（冻透融透再交替；管盖别浸入乙醇干冰浴）。
6. 再次脉冲超声 5–10×10 s。关键：结束时样品应呈水样；若仍粘稠说明基因组 DNA 未剪断，重复冻融+超声。
7. 20,000 × g、22°C 离心 10 min，上清转新 LoBind 管。
8. BCA 法定量。−80°C 保存或直接消化。

第 2 步 · 蛋白酶解（2 天）

关键：去垢剂与 LC-MS/MS 不兼容，本流程用改良 SP3 法去垢剂消化；替代方法必须同样能除尽去垢剂。

1. 按 BCA 结果取 1000 μg 蛋白（最低可到 100 μg，试剂体积按比例缩放）入 2.0 mL LoBind 管，用裂解液补至 400 μL。
2. 加入 2 pmol SUC2 转化酶。关键：SUC2 重度糖基化、与人鼠蛋白组无同源，作为全程内标监控制备质量与批间变异。
3. 还原：加 4 μL 0.5 M DTT（终 5 mM），60°C 30 min。
4. 复温至室温后烷基化：加 20 μL 0.5 M IAA（终 25 mM），室温避光 30 min。
5. 终止：再加 4 μL 0.5 M DTT，室温 10 min。
6. SP3 磁珠：亲水/疏水珠 1:1 混合，磁力架上 1000 μL 水洗 3 次，重悬至 50 mg/mL（可提前配好 4°C 存 1 周）。按珠:蛋白 = 10:1（wt/wt），1000 μg 输入对应 200 μL 珠悬液。
7. 加 200 μL 珠悬液到样品，弹管混匀——不要吹打（珠子粘枪头会丢珠）。
8. 加 1400 μL 无水乙醇（终 70%），弹管混匀，22°C、1000 rpm 摇 5 min。关键：转速不要超 1000 rpm，否则珠子糊壁。
9. 磁力架 1 min，小心吸走上清；1000 μL 80% 乙醇旋转洗珠、吸走，尽量去净乙醇后晾干。
10. 消化混合液：200 μL 100 mM ABC + 20 μL 1 μg/μL Trypsin/LysC（酶:底物 = 1:50），涡旋 1 min 重悬珠子。
11. 37°C、900 rpm 消化 16 h。
12. 2000 × g 离心 30 s，磁力架 1 min，取上清（肽段）入新管；珠子加 100 μL 水涡旋 5 min 回收残肽，合并。
13. 二次磁转移确保无珠残留（SP3 珠不可冻存）。SpeedVac 完全蒸干。暂停点：−80°C 可存。

第 3 步 · 糖肽氧化与酰肼偶联（1 天）

1. 干燥肽段用 200 μL 偶联缓冲液（pH 5.5）复溶，涡旋 2 min。
2. 氧化：加 10 μL 200 mM 偏高碘酸钠（终 10 mM），22°C 避光 30 min。关键：必须暗处进行；浓度与时间都要卡准——氧化不足或过度都会让反应位点变少，检出率骤降。
3. 淬灭：加 20 μL 200 mM 硫代硫酸钠（终 20 mM），22°C 涡旋 10 min（本流程新增，防止糖链过氧化）。
4. 酰肼珠准备（可与氧化同步）：取 60 μL 珠浆，750 μL 水洗 3 次（850 × g、22°C、30 s），再用偶联缓冲液洗 1 次，重悬于 100 μL 偶联缓冲液。
5. 把肽段转移进含珠管（样品加到珠子上，别反过来——酰肼珠很粘），总体积 300 μL。
6. 22°C 旋转偶联 16 h。糖链醛基与酰肼共价成键，糖肽被"钉"在珠上。

第 4 步 · 洗涤珠结合糖肽（2 h）

用真空 manifold + Mobicol（带滤膜底）+ 注射器组合洗涤（离心/液体工作站等替代方案亦可）。

1. 组装：LuerLock 转接头装上 manifold → 接带滤膜的 Mobicol → 上接注射器 → 连真空。
2. 预洗 Mobicol：10 mL HPLC 级乙腈 → 10 mL 水。
3. 转移珠子到 Mobicol 滤膜上，用 300 μL 偶联缓冲液涮洗原管和枪头一并转入（酰肼珠极易挂壁挂头，涮洗不能省），重新接上注射器。
4. 依次用以下溶液各 10 mL 洗涤（每道过完立刻关三通，别让珠子抽干）：偶联缓冲液 → 1.5 M NaCl → 水 → 甲醇 → 80% 乙腈 → 水 → 100 mM ABC。

洗完的珠子上只剩共价偶联的 N-糖肽，非糖肽与非特异结合物全部去除。

第 5 步 · PNGase F 酶解释放（2 天）

PNGase F 切下糖链（糖链留在珠上），肽段的天冬酰胺脱酰胺为天冬氨酸（N→D，+0.98 Da），这就是"曾为 N-糖基化"的质谱标志。

1. 珠子用 200 μL 100 mM ABC 重悬，转入新 1.5 mL 管（用 200 μL ABC 涮 Mobicol 和枪头，收回挂在滤膜上的珠）。
2. 850 × g、22°C 离心 1 min 沉珠，去上清，重悬于 100 μL ABC。关键：pH 必须在 7.5–8，pH 不对会导致去糖基化不完全、检出率低。
3. 加 5 μL PNGase F（1 U/μL），37°C、1000 rpm 消化 16 h。
4. 850 × g 离心 1 min，用细长枪头取上清——千万别带走珠子。
5. 珠子加 300 μL 80% ACN/0.1% TFA 涡旋 1 min、离心取上清合并，重复 1 次。
6. SpeedVac 浓缩至 <100 μL（主要为除乙腈，高乙腈会毁掉下一步 C18 清洁）。

第 6 步 · C18 脱盐（≥4 h，视浓缩速率）

1. 20,000 × g 离心 30 s 沉掉残余珠子转新管——一颗珠都不能上 C18，会堵柱。
2. 酸化至 0.1% TFA。
3. 自装 C18 StageTip 脱盐（1500 × g、22°C；上机前最后一道清洁，所有溶剂必须 HPLC 级）：活化（甲醇 1 次 + 乙腈 1 次）→ 平衡（0.1% TFA 水）→ 上样、流出液回载 1 次 → 洗涤（0.1% TFA 水 2 次）→ 洗脱（80% ACN/0.1% TFA，洗脱 2 次）。
4. SpeedVac 蒸干。暂停点：−20°C 或 −80°C 保存待上机。

第 7 步 · LC-MS/MS 采集（每样 1–4 h）

1. 干燥肽段用 25 μL A 相（0.1% 甲酸水）复溶，NanoDrop 定量。经验值：1000 μg PDX 裂解液最终回收 4–16 μg 糖肽。
2. 按厂商建议掺入 iRT 标准肽（11 条合成肽，监控色谱保留时间稳定性）。
3. 参考采集参数（Orbitrap Eclipse + Neo Vanquish，trap 柱 + 50 cm ES903 分析柱，上样 500 ng）：125 min 梯度（B 相 0–6% 5 min、6–30% 105 min、30–48% 10 min、48–95% 5 min）；DDA 正离子模式；MS1 350–1550 m/z、分辨率 120,000、AGC 250%、最大注入 50 ms；MS2 分辨率 15,000、AGC 200%、最大注入 100 ms；隔离窗口 1 m/z、动态排除 55 s、HCD 碰撞能量 30%。

第 8 步 · 搜库与物种拆分（30 min–6 h）

1. 用 MaxQuant v2.4.2（或 MSFragger、Mascot、Comet 等）搜库。关键：数据库必须是人+鼠拼接库，并包含 SUC2 与 iRT 序列——PDX 里同时存在两个物种的蛋白。
2. 搜索参数：必须把"N 脱酰胺"设为可变修饰（PNGase F 留下的糖基化位点证据）；其余按常规 bottom-up 设定（胰酶特异性、Met 氧化可变、Cys 氨甲酰甲基化固定等）。
3. N-糖肽过滤（最关键的手工步骤）：搜索算法不会自动只用"带位点特异脱酰胺、落在序列子内"的肽段做蛋白分组，必须用 MaxQuant 的 Asn-AspSites.txt 修饰文件手动过滤——保留 N→D 脱酰胺定位概率 >0.8 的肽段，再要求脱酰胺位点落在 N-X-S/T/C 序列子（X≠P）上。双重过滤可排除自发脱酰胺与质量误差假阳性。
4. 物种归属：按肽段映射的蛋白分入"人特有 / 鼠特有 / 人鼠共有"。可选加固：把人特有肽段再比到 TrEMBL 和品系特异小鼠基因组（含 SNP/indel）预测序列，与鼠特有或共有肽段冲突的改判为共有。
5. 定量：人鼠共有肽段来源无法区分，一律剔除；人特有肽段加和为人源蛋白定量，鼠特有肽段加和为鼠源蛋白定量。

预期结果

• 深度：每个 PDX 样本中位检出 1446 条 N-糖肽（536–2225）、794 个 N-糖蛋白（327–1158）；检出量随起始材料与样本类型浮动。
• 表面定位：绝大多数检出糖蛋白应有预测表面定位（SPC>0）和/或信号肽。
• SUC2 内标：每样检出 ≥2 条 SUC2 糖肽即认为制备合格；常见检出肽 AEPILNISNAGPWSR（RT≈97.2 min）、FATNTTLTK（38.1 min）、NPVLAANSTQFR（56.9 min）、RNDSGAFSGSMVVDYNNTSGFFNDTIDPR（103.7 min）；同复杂度样本间 SUC2 强度 log2 CV <5%。
• 批间质控：每批随行一个商品血清处理 QC、每批上机前跑一个混合裂解液技术 QC；要求蛋白检出 CV <5%、QC 间 Spearman 相关 >0.9；iRT 保留时间 CV 约 2.7–4.5%。
• 物种分布：理论酶切预测约 20% 的 N-糖肽在人鼠间保守；人:鼠特有肽段比例随 PDX 肿瘤类型与移植部位变化，应与生物学预期相符。

Troubleshooting

问题 1：N-糖蛋白检出数低于预期

• 检查偏高碘酸钠与 PNGase F 的储存是否符合厂商要求，发现不当储存立即换新（偏高碘酸钠即使原包装避光，也建议再裹一层铝箔）。
• 严守氧化条件：终浓度 10 mM、≤25°C、≤30 min——过氧化会产生非经典修饰并破坏糖链，氧化不足则偶联位点不够。
• 聚合物/去垢剂污染会拖垮数据质量：检查试剂等级、玻璃器皿清洗方式、枪头与管材。
• 也可能是样品本身糖基化水平低的生物学原因；同时查看 SUC2 内标表现以判断流程与仪器是否正常。

问题 2：批间变异大

• 大队列设计必须随机化+区组化。
• 用 SUC2 与 iRT 内标分别监控制备与上机变异；每批随行处理 QC 和技术 QC。

问题 3：胰酶消化不完全（第 2 步）

• 标准 1:50（酶:底物）+ 16 h 过夜；必要时加酶补至 1:25。
• 消化前用 pH 试纸确认 ABC 缓冲液 pH 在 7.0–8.0。
• 酶避免反复冻融（最多一次），最好现配或单次分装。
• 可疑时跳过氧化/偶联/释放，直接脱盐上机评估检出与漏切位点。

局限性

1. 不能直接证明表面定位：富集是在裂解+酶解后的样品上做的，内质网/高尔基体等胞内 N-糖蛋白同样会被抓到。需要结合表面预测算法（SurfaceGenie、CIRFESS、SURFY 等）打分，关键蛋白仍需实验验证定位。
2. 定量受糖基化状态干扰：糖链微观/宏观不均一性加上 PNGase F 对不同糖型切割效率不同，定量可能反映糖基化差异而非真实丰度差异——发现阶段的候选仍要用正交方法验证。
3. 只覆盖 N-糖基化：O-糖肽理论上也能被酰肼偶联（共享邻位二醇结构），但缺少像 PNGase F 那样的广谱 O-聚糖酶，无法稳定生成"曾为 O-糖基化"的肽段。

通讯作者

技术问题：Meinusha Govindarajan（meinusha.govindarajan@mail.utoronto.ca）；资源请求：Thomas Kislinger（thomas.kislinger@utoronto.ca）。