脱髓鞘损伤下成年海马神经前体细胞的功能表征方案

Protocol for functional characterization of adult hippocampal neural precursor cells under demyelinating injury conditions in mice

Shiva Nemati, Soheila Karimi-Abdolrezaee（加拿大曼尼托巴大学生理与病理生理学系 · 曼尼托巴多发性硬化研究中心 / 曼尼托巴儿童医院研究所）

STAR Protocols · 2026-08-26 · DOI: 10.1016/j.xpro.2026.104803 · PMC13544388 · PMID 42658684

一句话背景

成年海马齿状回的神经前体细胞（Hip-NPC）终生维持神经发生、支撑学习记忆。作者团队此前在 Stem Cell Reports（2026）证明：慢性脱髓鞘会把 Hip-NPC 推向"静息态"，导致修复失败、海马变性与持续认知损伤。要解释"干细胞为什么罢工"，需要一套多维、可量化、可复现的功能评估框架——本方案用铜腙（cuprizone, CPZ）脱髓鞘小鼠模型，从自我更新、激活/增殖、代谢（蛋白合成）、三系命运指定四个维度给 Hip-NPC 做全面"体检"。除脱髓鞘外，同样适用于神经退行性疾病、卒中、创伤性脑损伤等海马病理模型。

方案总览

动物模型：Nes-CreERT2（JAX 016261）与 mT/mG（JAX 007676）小鼠，雌雄兼用，5–6 月龄，C57BL/6 背景。动物操作经曼尼托巴大学动物护理委员会批准（#20-065、#24-054）；原代神经组织与细胞培养按 CL2 生物安全要求在合格生物安全柜内操作。

实验前准备

一、激素混合液（200 mL，约 4 h）

基础培养基：DMEM/F12 170 mL + 30% 葡萄糖 4 mL + 7.5% NaHCO₃ 3 mL + 1 M HEPES 1 mL。

激素补充液（50 mL 离心管内直接称重加入，最后用 DMEM/F12 定容至 22 mL）：

混匀后与基础培养基合并，0.2 μm 注射器滤器除菌，5 mL/管分装 −20°C。每 5 mL 分装够配 50 mL 无血清培养基；解冻后 4°C 可存 3 天，不可反复冻融。

二、生长因子（约 3 h）

注：三者均避免反复冻融；解冻后 4°C 一周内用完。

三、CPZ 饲料与体内 EdU

• CPZ 饲料：200 mg CPZ 与 100 g 粉碎标准鼠粮混匀（0.2% w/w）；4°C 密封保存不超过 3 天，尽量现配现用。
• 体内 EdU：625 mg EdU 溶于 50 mL 1× PBS（pH 7.4）得 12.5 mg/mL 母液，温热 + 涡旋助溶（必要时加少量 DMSO），0.2 μm 滤器除菌，1 mL/管避光 −20°C 分装；解冻后如有沉淀需温热复溶，4°C 避光 2 天内用完。腹腔注射给药，每只约 25 g 小鼠注射 100 μL。本研究中为分离前每日 12.5 mg/kg 连续注射一周（剂量与频次按实验设计优化）。

四、培养基与工作液配方

无血清培养基 SFM（50 mL）

CRITICAL：SFM 4°C 保存不超过 2 周。

NPC 增殖培养基（约 50 mL）

SFM 50 mL + EGF 20 μL（终 20 ng/mL）+ FGF2 10 μL（终 10 ng/mL）+ 肝素 7 μL（终 1.464 μg/mL）。加生长因子后 4°C 两周内用完。

NPC 分化培养基（50 mL）

SFM 49.5 mL + KnockOut™ 血清替代物 KOSR 500 μL（终 1%，可用 0.5%–1% FBS 替代）。4°C 保存，两周内使用。

PBS 缓冲液（1 L）

Na₂HPO₄ 1.14 g（8 mM）+ NaH₂PO₄ 0.27 g（2.25 mM）+ NaCl 9 g（154 mM），定容至 1 L，调 pH 7.4；细胞培养用需高压/过滤除菌并在 37°C 使用，配好后 3 个月内用完。

3% 多聚甲醛 PFA（100 mL）

90 mL ddH₂O 加热至约 60°C 后离火，边搅拌边缓慢加入 3 g PFA 粉，滴加 10 N NaOH 数滴至溶液澄清，加 10× PBS 10 mL 定容，调 pH 7.4–7.5，过滤去除未溶颗粒。4°C 可存数天，细胞固定前回温至 37°C。

ICC 封闭液（100 mL）

PBS + BSA 1%（1 g）+ 脱脂奶粉 5%（5 g）+ Triton X-100（胞浆标志物用 0.3% = 300 μL；核标志物用 0.5% = 500 μL）。4°C 一周内用完。通透化浓度按标志物定位选择，兼顾通透效率与细胞完整性。

EdU 反应混合液（250 μL）

注：现配现用，加样前回温 37°C。

Click-iT® OPP 反应 cocktail（1002.5 μL）

1× Click-iT OPP 反应缓冲液 880 μL + 铜保护剂（组分 D）20 μL + Alexa Fluor® picolyl azide（组分 B）2.5 μL + 反应缓冲液添加剂（组分 E）100 μL。配好后 15 min 内使用，加样前回温 37°C。

五、关键试剂速查（节选）

设备：II 级生物安全柜、37°C/5% CO₂/95% 湿度培养箱、Leica Mateo FL 与 Zeiss AxioImager M2 荧光显微镜、Thermo Nunc Lab-Tek II 8 孔腔室载玻片等。软件：Fiji/ImageJ、GraphPad Prism 10。

分步方案

步骤 A：CPZ 诱导脱髓鞘小鼠模型（5–10 周）

持续摄入 CPZ 会导致多脑区（含海马）少突胶质细胞丢失、脱髓鞘与反应性胶质增生，是研究脱髓鞘与内源性修复的经典模型。饲喂时长决定病理阶段：

• 5 周 → 急性脱髓鞘：停药后可自发再髓鞘化与恢复；
• 10 周 → 慢性脱髓鞘：自发再髓鞘化受损、进行性神经变性与认知衰退。

1. 以 0.2%（w/w）CPZ 饲料饲喂小鼠 5 周（急性）或 10 周（慢性）。本方案同样适用于其他小鼠品系。

背景：作者团队已证明，脑脱髓鞘使 Hip-NPC 从激活态短暂转向类静息态（Nemati et al., Stem Cell Reports, 2026）。

步骤 B：神经球克隆形成实验（8 天）——评估自我更新

原代 Hip-NPC 从对照与 CPZ 小鼠齿状回分离后以克隆密度培养，神经球形成能力即细胞激活、自我更新与扩增潜力的功能性指标。

1. 第 1 天：解剖成年小鼠脑，从齿状回分离 Hip-NPC（分离流程按 Ahmed et al., STAR Protocols 的"Dissection and isolation of aNSCs"执行至第 14 步）。
2. 细胞重悬于 10 mL NPC 增殖培养基，转入 25 mL 组织培养瓶，37°C、5% CO₂ 孵育 24 h。CRITICAL：操作轻柔、步间迅速，维持细胞活力。
3. 第 2 天：轻旋培养瓶重悬细胞，转入 15 mL 锥形管，300 × g 离心 5 min（37°C）。
4. 弃上清，沉淀重悬于 1–2 mL 新鲜增殖培养基。
5. 台盼蓝拒染法计数活细胞：10 μL 细胞悬液 + 10 μL 台盼蓝混匀，取 10 μL 加载血球计数板，10× 光镜计数 4 个 4×4 大格中未染色活细胞，调整至克隆密度 10 细胞/μL。每孔（500 μL 培养基）所需悬液体积 = 4 大格细胞总数 ÷（4 × 稀释倍数 2 × 10⁴）换算。
6. 种入 24 孔板，每孔 500 μL 增殖培养基；37°C、95% 湿度、5% CO₂ 培养 7 天。

为什么只养 7 天：常规神经球实验常用 10–14 天，但为最大限度保留体内脱髓鞘赋予的病理表型，本方案选 7 天（加解剖日共 8 天）——既保证神经球充分形成，又缩短体外培养时间。需自行平衡扩增与表型保持。

7. 第 7 天光镜下对每孔全视野拍照，统一用 10× 或 20× 物镜（所有图像必须同一物镜倍数，保证尺寸分析可比）。
8. 计数直径 > 20 μm 的球形克隆。如需传代或分化，神经球可继续二次/三次成球实验。

步骤 C：神经球数据分析（成像 1 天 + 分析作图 2 天）

• Fiji 测直径：打开带标尺图像 → 沿标尺画线 → Analyze > Set Scale 定标 → Set Measurements 全不勾选 → 沿神经球最大径（过中心、边到边）画线 → Analyze > Measure，结果窗"Length"即直径（μm）。每个生物学重复的全部图像重复测量，导出 Excel。
• GraphPad Prism：作均值柱状图比较组间平均直径；另作尺寸频率分布并做高斯正态分析。
• Excel 正态分布：对各直径列计算 =AVERAGE(B1:Bn)（均值）与 =STDEV.S(B1:Bn)（标准差），再用内置函数 =NORM.DIST(x, mean, standard_dev, FALSE) 求每个直径的概率密度，直径列 + 正态分布列插入散点图（无连线）。曲线左移 = 神经球变小，右移 = 变大，直接反映 NPC 行为的生物学变化。

步骤 D：神经球机械（无酶）传代（1 h 准备 + 15 min 操作）

无酶机械解离，最大限度减少细胞应激、保留 Hip-NPC 特性。7 天原代球（直径约 100–150 μm）适合传代；直径超过 250–300 μm 时核心缺氧营养不良，活力与干性下降。

1. 配 NPC 增殖培养基并 37°C 水浴预热。
2. P1000 将培养瓶/孔内容物转入 15 mL Falcon 管，500 × g 离心 5 min。
3. 弃上清，加 1 mL 新鲜增殖培养基。
4. 用 1000 μL 枪头吹打（枪头伸至管底、轻柔吹打、避免气泡）至无肉眼可见团块。
5. 以 5 × 10⁵ – 1 × 10⁶ 细胞 / 25 cm² 未包被培养瓶密度种回，继续培养一周。

Hip-NPC 体外最多可扩 6 代，但通常传到三级神经球为止。病理来源 Hip-NPC 若体外恢复自我更新能力，提示其处于"静息态"而非不可逆的"衰老样"状态。

步骤 E：NPC 铺板（约 13–14 h）

把神经球解离成单细胞，铺在包被好的表面上贴壁 12 h，形成适于定量分析的贴壁单层。

1. 12 mm 盖玻片高压灭菌，生物安全柜内拆包，无菌镊转入培养板。
2. GFR-Matrigel 冰上融化（层黏连蛋白、IV 型胶原、entactin、硫酸乙酰肝素蛋白聚糖为主要成分，支持 Hip-NPC 贴壁、存活与增殖）。CRITICAL：Matrigel 室温即快速聚合——全程冰上操作，枪头与管子预冷。
3. 按需分装（分装时管置冰上、动作快）。
4. 包被液：40 μL Matrigel 母液 + 1 mL 预冷 DMEM/F12（约 0.52 mg/cm²）。
5. 包被液加入盖玻片或 8 孔腔室载玻片每孔，轻晃平板使表面均匀覆盖；37°C 孵育 30 min，随即用于铺板。
6. 临用前轻柔吸弃 Matrigel 液，无菌 PBS 轻洗一次。吸弃后切勿让包被面干掉——干燥会破坏 Matrigel 层、影响贴壁与活力。
7. 按步骤 D 解离增殖中的神经球为单细胞，计数定密度。
8. 用增殖培养基配制目标浓度的单细胞悬液（本方案每孔 10,000 个 NPC），按孔数与每孔体积（500 μL/孔）算总量，轻柔混匀后分装，铺后轻旋平板使细胞均匀分布。
9. 孵育 12 h 待贴壁，再进行下游分析。

步骤 F：EdU + NESTIN 共染测增殖（2 天）

EdU 是胸苷类似物，仅在进行 DNA 复制的 S 期细胞中掺入新合成 DNA，再经铜催化"点击化学"连接荧光叠氮探针即可无抗体检测增殖细胞；与 NPC 标志物 NESTIN 共染即可按细胞类型量化增殖。本方案先做 NESTIN 免疫荧光，最后做 EdU 检测。

CRITICAL：小鼠必须在取材前接受 EdU 注射（本研究为分离前每日 12.5 mg/kg × 1 周；时机、次数、剂量按实验设计优化）。

1. 原代神经球形成与分析后，将 Hip-NPC 铺为 Matrigel 包被的单层，贴壁 12 h。
2. 免疫荧光染色：
   • 轻柔吸弃培养基，1× PBS 充分洗涤；
   • 加入预热 3% PFA 固定 20 min，PBS 充分洗涤后再 3 次 × 5 min 洗涤去除残余 PFA；
   • 含 0.3% Triton X-100 的封闭液 37°C 封闭 1 h（低转速摇床，保证均匀、减少非特异结合）；
   • NESTIN 一抗（1:300）37°C 孵育 1.5 h 或 4°C 过夜 12 h；
   • PBS 3 次 × 5 min 洗涤；对应二抗（1:500，不含 Triton-X 的封闭液）37°C 1 h；
   • PBS 3 次 × 5 min 洗涤。CRITICAL：此后所有步骤避光。
3. EdU 标记：
   • 含 0.5% Triton X-100 的封闭液通透 30 min（保证检测试剂进入细胞核）；
   • 新鲜配制的 EdU 反应混合液 37°C 孵育 30 min、避光；
   • PBS 3 次 × 5 min 洗涤；DAPI 1:10,000 37°C 复染核 15 min；
   • PBS 2 次 × 5 min 洗涤，封片剂封片，静置定型后成像。

步骤 G：EGFR + NESTIN 共染测激活态（2 天）

EGFR 在增殖、激活态 NPC 中高表达，是评估 NPC 活性状态的经典标志（EGFR 信号调控 NPC 增殖、存活与对生长因子的响应）；海马中 EGFR⁺ 的 NPC 通常代表激活/增殖态而非静息态前体。操作：对 EGFR、NESTIN 依次重复步骤 F 的免疫荧光流程完成共染，再按步骤 F 的 EdU 部分（f 项）封片。

步骤 H：活性评估数据分析（成像 2 天 + 分析作图 4 天）

• 20× 物镜下每孔/盖玻片随机非重叠视野取图（如 10 个视野）。每个生物学重复每条件 ≥300 个细胞；所有组别必须同一物镜、倍数与曝光参数——荧光强度分析（尤其 EGFR）尤其关键。CRITICAL：用阴/阳性对照片确定曝光参数，全组别保持一致。
• 增殖：量化 EdU⁺/NESTIN⁺/DAPI⁺ 占 NESTIN⁺/DAPI⁺ 总数的百分比；活性：量化 EGFR⁺/NESTIN⁺/DAPI⁺ 占 NESTIN⁺/DAPI⁺ 总数的百分比。
• 计数工作流：打开图像 → 多通道时 Image > Color > Split Channels 分通道 → 确定总细胞群通道（NESTIN⁺/DAPI⁺）与目标标志物通道（EdU⁺ 等）→ 用 Fiji 手动计数工具或 Cell Counter 插件（Plugins > Analyze > Cell Counter）按预设阳性标准计数 → 排除伪影、非特异信号与背景 → 结果录入 Excel → 阳性率(%) = 阳性细胞数 ÷ 总细胞数 × 100 → 所有图像、重复、组别统一参数重复分析。
• EGFR 荧光强度测量（归一到 NESTIN⁺/DAPI⁺ 细胞数，评估单细胞 EGFR 表达水平）：
  1. 所有组别图像用完全相同的显微镜设置采集（激光功率、探测器增益、曝光、针孔、物镜）；
  2. 用原始文件、无损格式（.tif）保存，避免压缩伪影；
  3. Fiji 打开 → 定标 → 分通道 → 目标通道转 8 位（也可转 16 位保留更大动态范围）；
  4. 背景扣除（Process > Subtract Background，滚球半径：小点状结构 20–30 像素、较大胞体 50–100 像素），全组别设置一致；
  5. 阈值分割定义阳性细胞（Image > Adjust > Threshold）——全组别使用同一阈值方法与数值；
  6. 仅在需要分析特定亚区时手动设 ROI（体外数据推荐全视野分析，减少选择偏倚）；
  7. Analyze > Set Measurements 勾选 Area、Mean gray value、Integrated density、Min/Max gray value、Display label → Analyze > Measure；
  8. 结果导出 Excel，积分密度 ÷ NESTIN⁺/DAPI⁺ 细胞数 = 单细胞信号水平；
  9. Prism 作图；两组比较用非配对 Student's t 检验，≥3 组用单因素方差分析。

步骤 I：OPP 掺入实验测代谢（2 天）

O-丙炔基-嘌呤霉素（OPP）掺入新生多肽链，经点击化学荧光检测，可在单细胞水平无放射性评估全局蛋白合成（翻译活性），并可联合免疫染色做细胞类型特异分析。使用 Click-iT™ Plus OPP Alexa Fluor™ 647 试剂盒，按厂商说明并针对 Hip-NPC 优化。

1. 原代 Hip-NPC 铺为 Matrigel 包被单层，贴壁 12 h。
2. 试剂盒各瓶回温至室温 30 min；OPP 试剂短暂离心以充分回收。
3. 组分 E 配 10× 母液：溶于 2 mL 去离子水，≤−20°C 存放（可稳定 1 年）。
4. 组分 C 用去离子水 1:10 稀释配 1× 反应缓冲液（涮瓶保证转移完全；2–8°C 可存 6 个月；每次实验现配所需量，未稀释母液可存 1 年）。
5. 组分 A（Click-iT OPP 试剂）用量按细胞类型经验优化——小鼠 Hip-NPC 终浓度 20 μM。
6. OPP 标记流程：
   • 组分 A 按 1:1000 稀释入培养基，配 20 μM 工作液；
   • 吸弃孔内培养基，8 孔腔室载玻片每孔加 100 μL 工作液（或足够覆盖盖玻片/孔面的体积）；
   • 37°C、95% 湿度、5% CO₂ 孵育 30 min；
   • 吸弃含组分 A 的培养基，预热 PBS 洗一次；
   • 加 500 μL 3% PFA，室温固定 20 min；PBS 洗 2 次 × 5 min；
   • 含 0.5% Triton X-100 的封闭液通透 30 min，37°C 孵育 20 min；PBS 洗 2 次 × 5 min；
   • 每孔加 500 μL 1× Click-iT OPP 反应 cocktail，孵育 30 min（cocktail 配后 15 min 内使用）；
   • DAPI 复染封片，或继续对其他蛋白做 ICC（本方案联用 NESTIN 免疫染色评估代谢活性）。

数据分析：测 OPP 荧光强度并归一到 NESTIN⁺/DAPI⁺ 总细胞数，得单细胞蛋白合成水平；作图与统计同步骤 H。

步骤 J：三系分化评估命运指定（10 天）

1. 第 7 天原代神经球铺为 Matrigel 包被单层，贴壁 12 h。CRITICAL：分化实验最佳铺板密度为 8 孔腔室载玻片每孔 10,000 细胞；过密培养会加剧细胞死亡、影响下游分析。
2. 次日检查贴壁与培养质量：贴壁良好应几乎无漂浮细胞（分化前的关键质控）。
3. 吸弃增殖培养基，换分化培养基（每孔 500 μL）。换液当天记为分化第 1 天。
4. 隔天半换液维持：每孔移除 250 μL 旧液、补 250 μL 新鲜分化培养基，直至第 7 天。
5. 分化 7 天后可用免疫荧光、qPCR、WB、流式等多种方法分析；本方案以免疫荧光评估分化格局。
6. 分化 Hip-NPC 免疫荧光染色：
   • 3% PFA 固定 20 min，按步骤 F 做 ICC；
   • 一抗 4°C 过夜 12 h：抗-β-TUBIII 1:400（泛神经元）、抗-GFAP 1:500（星形胶质细胞）、抗-OLIG2 1:500（少突胶质谱系）；
   • 完成 ICC 并封片。

数据分析：按步骤 H 取图；Fiji 计数 β-TUBIII⁺/DAPI⁺、GFAP⁺/DAPI⁺、OLIG2⁺/DAPI⁺ 分别占 DAPI⁺ 总核的百分比；Prism 作图，组间用非配对 Student's t 检验。

预期结果

注意：不同疾病模型与干预可产生不同的神经球谱式与活性读出，应结合生物学背景解读。

局限性

• 神经球实验：体外培养不能完全复现体内微环境（细胞外基质、血管、免疫与炎症信号）；读出以形态学参数（数量/直径）为主，不直接反映功能状态与分子机制，需与活性分析、基因表达与通路分析互补。
• 活性评估：EdU 只反映限定时间窗内的 S 期进入，不能预测长期结局；NESTIN/EGFR 表达随细胞状态与语境变化，与 EdU 联用可增强解读；免疫荧光定量存在技术变异，标准化成像与分析流程可保障组间可比。
• 代谢评估：OPP 是翻译活性的"快照"而非长期动态，需多时间点分析；荧光强度受染色效率、成像设置与背景信号影响，标准化采集与分析可最小化变异。
• 命运指定：体外分化缺乏 niche 来源信号、细胞间相互作用与脱髓鞘相关炎症线索，也不能完全模拟体内长期成熟与功能整合；但该平台仍可用于稳态与病理条件下 NPC 行为的稳健对比，并支持高通量药物筛选。

Troubleshooting

资源与联系

• Lead contact：Soheila Karimi-Abdolrezaee（soheila.karimi@umanitoba.ca）；技术支持：Shiva Nemati（shiva.nemati@umanitoba.ca）
• 未产生新试剂、新数据集与代码。
• 基金：加拿大卫生研究院（PJT-191850）、多发性硬化协会加拿大分会（1241879）。