Perturb-Seq 心肌细胞发育基因筛选：在分化过程中全基因组找人必需基因

Protocol to identify genes required for cardiomyocyte development using Perturb-Seq

- 作者：S. Sivakumar, L. Wang, H. Zhao 等（ UT Southwestern 医学中心，Gary C. Hon / Nikhil V. Munshi 实验室）

- 期刊：STAR Protocols（Cell Press）7 卷 3 期｜发表日期：2026-08-25

- DOI：10.1016/j.xpro.2026.104790｜PMC：PMC13543896

- 方法学来源：Sivakumar et al.（本篇为其标准化实验方案；处理管线 Pyspade 与细胞系资源均已公开）

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一句话总结

这是一套在人多能干细胞（PSC）向心肌细胞分化过程中做 CRISPRi Perturb-Seq 的完整方案：把覆盖全基因组转录因子（TF）的 sgRNA 慢病毒文库导入稳定表达 dCas9-KRAB 的 PSC，经 FACS 富集、GiWi 法分化为心肌细胞，再用细胞 hashing + 超量上机把 scRNA-seq 成本压到最低，最终在单细胞层面读出每个基因被抑制后对心肌分化的影响。

亮点

• 发育场景做 Perturb-Seq 的完整解法：分化过程细胞群体高度异质，本方案通过关键时间点的 sgRNA 覆盖度 QC 和 FACS 富集，保证筛选全程文库复杂度不塌；
• 成本控制做进了流程：12 色 cell hashing 多样本合并 + 超量上机（每库回收 6 万细胞，是试剂盒标称 2 万的 3 倍），大幅摊薄单样本测序成本；
• dCK 细胞系即拿即用：组成型/诱导型 dCas9-KRAB 从基因组安全港湾位点稳定表达，CRISPRi 抑制效率在细胞群体间均一，细胞系与质粒均已公开存放（Addgene / WiCell）；
• 标准 GiWi 分化无缝衔接：CHIR99021 激活 → Wnt-C59 抑制的经典 Wnt 时序调控，第 12 天即可收获心肌细胞上机。

开始之前（Before you begin）

Perturb-Seq 把 CRISPR 筛选和单细胞 RNA 测序合二为一，但大规模实验费用高，而在发育研究中使用还会被分化异质性进一步搅局。本方案针对的正是这个痛点：在心肌细胞分化全程施加 CRISPRi 干扰，用单细胞转录组读出每个转录因子被压制后的下游后果。作者已用同一套流程完成了心肌细胞和神经元两种分化场景的筛选。

方案的前提是使用基因组安全港湾位点表达 dCas9-KRAB（dCK）的 PSC 系（H9-dCK、WTC11-dCK，均为自建并已公开），保证 CRISPRi 机器在细胞群体中均一稳定表达；sgRNA 导入后靶基因抑制一致，才能在发育阶段做 Perturb-Seq。实验成本高、周期长，方案在若干关键节点设置了 QC 步骤，请勿跳过。

创新点

在体外分化过程中执行 Perturb-Seq 的全套操作，包括 sgRNA 文库构建与感染、心肌分化、细胞 hashing、超量上机、scRNA-seq 及数据分析；配套的 Pyspade 处理管线开源于 GitHub（Hon-lab/Perturb-Seq-Processing-Pipeline）。

机构审批

所有人多能干细胞操作须符合所在机构干细胞研究监督委员会（SCRO）规范（原文为 UT Southwestern 医学中心 SCRO）。慢病毒操作遵守所在机构生物安全规程。

关键材料清单（节选）

核心试剂

Chromium Next GEM Single Cell 5′ HT v2（Feature Barcode，CRISPR 筛选 + 细胞表面蛋白）	10× Genomics	PN-1000356
Chromium Next GEM Single Cell 3′ HT v3.1（Dual Index）	10× Genomics	PN-1000370
SPRIselect Reagent	Beckman Coulter	B23318
KAPA HotStart ReadyMix（2×）	Roche	07958935001
NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix	NEB	E2621X
LentiGuide(10×)-BFP-Puro 骨架	Addgene（见原文）	—
TotalSeq-C 抗人 Hashtag 抗体 1–10、12、13	BioLegend	394661–394685
Cardiac Troponin T Mouse-PE（克隆 13-11）	BD Biosciences	564767
mTeSR Plus	StemCell Technologies	100-0276
TrypLE Select	Gibco	12563-029
CloneR2	StemCell Technologies	—
Rock Inhibitor（Y-27632）	Tocris	1254/10
Normocin	InvivoGen	—
L-抗坏血酸-2-磷酸三钠盐	Sigma/Wako	49752 / USA321-44823
重组人白蛋白（OsrHSA）	ScienCell	OsrHSA
RPMI 1640（含 L-谷氨酰胺）	Corning/Fisher	10-041-CV / MT10041CV
B-27 Supplement（50×，无血清）	Gibco	17504044
KnockOut Serum Replacement（KOSR）	Gibco	10828028
Thiazovivin	Sigma	SML1045
CHIR99021	Fisher	50-202-8603
Wnt-C59	Sigma-Aldrich	500496000
Transporter 5 转染试剂	Kyfora Bio	26008-50
MinElute Gel Extraction Kit	Qiagen	28604
QIAquick Spin Columns	Qiagen	28115
DNeasy Blood & Tissue Kit	Qiagen	69504
Zymo Midiprep Kit（无内毒素柱）	Zymo Research	D4200/D4201
Endura Duo 感受态细胞	Lucigen（Fisher）	50-104-7945

关键设备

BioRad MicroPulser 电转仪（0.1 cm 电转杯）、Beckman Optima XL-100K 超速离心机（SW28 转子）、FACS 分选仪、Qubit 荧光计、Agilent TapeStation、10× Chromium 系统、Illumina 测序仪、Oxford Nanopore MinION/PromethION。

关键配方

① sgRNA 文库扩增 PCR（4×50 μL 体系，共 3.2 ng oligo）

Primer-F（10 μM）	2.5 μL
Primer-R（10 μM）	2.5 μL
sgRNA oligo pool（0.5 ng/μL）	1.6 μL
2× KAPA HotStart ReadyMix	25 μL
水	补至 50 μL

循环：95°C 30 s →（98°C 20 s、59°C 15 s、72°C 10 s）×5 →（98°C 20 s、65°C 15 s、72°C 10 s）×5 → 72°C 1 min → 4°C 保存。产物 139 bp，1.2% 琼脂糖胶回收。

② 骨架酶切：LentiGuide(10×)-BFP-Puro 15 μg + Esp3I 15 μL + 水补至 200 μL；0.7% 胶纯化。

③ NEBuilder 组装（2×100 μL）

酶切后 LentiGuide(10×)-BFP-Puro	1000 ng
sgRNA PCR 文库	40 ng
NEBuilder HiFi Master Mix	50 μL
水	补至 100 μL

50°C 孵育 60 min；0.8× SPRIselect 纯化，20 μL EB 洗脱。

④ sgRNA 批量测序 PCR-1（100 μL）：Fwd-v2（10 μM）5 μL + Rev（10 μM）5 μL + 质粒文库 0.125 μg（或基因组 DNA 0.5 μg）+ 2× KAPA 50 μL + 水补至 100 μL。循环：95°C 2 min →（98°C 20 s、55°C 20 s、72°C 20 s）×21（基因组 DNA）或 ×8（质粒）；若走纳米孔则分别增为 27 / 15 循环。72°C 1 min。

⑤ sgRNA 批量测序 PCR-2（加 TT index）：10× plate TT set A primer 20 μL + PCR-1 洗脱液 30 μL + 2× KAPA 50 μL。循环：98°C 45 s →（98°C 20 s、62°C 10 s、72°C 10 s）×8 → 72°C 1 min。终产物 275 bp。

⑥ CDM3 补充液：1.056 g L-抗坏血酸-2-磷酸溶于 50 mL 水，间歇混匀至澄清；加 2.5 g 重组人白蛋白溶匀；0.22 μm 真空过滤除菌；5 mL/管分装 −20°C。CDM3 完全培养基 = RPMI 1640 500 mL + CDM3 补充液 5 mL，4°C 可存 >4 周。

⑦ 选择培养基（Day 8 起） = RPMI 1640 500 mL + B-27 10 mL，4°C 可存 >2 周。

⑧ 慢病毒包装三质粒（每 10 cm 皿）：transfer 载体 8 μg + psPAX2 6 μg + pMD2G 2 μg，配 Opti-MEM 1 mL + Transporter 5 64 μL。

分步方案

步骤 1：sgRNA 质粒文库构建

目标：把 sgRNA 文库克隆进慢病毒骨架（LentiGuide(10×)-BFP-Puro）。

1. 整理靶基因清单与 sgRNA 序列。抑制全基因组所有 TF 时，直接采用已发表的 sgRNA 设计集；商业化合成 oligo pool。
2. 用低 EDTA TE 复溶 oligo pool 至 0.5 ng/μL（约 0.024 μM），按配方①做 4 管 50 μL PCR 扩增双链 sgRNA（合计 3.2 ng 模板）。
3. 合并 4 管产物，1.2% 琼脂糖胶电泳，切胶回收 139 bp 条带：用 2 根 MinElute 柱，每柱 12 μL EB 洗脱（共 24 μL），Qubit 定量。
4. 用 Esp3I 按配方②酶切线性化慢病毒骨架，0.7% 胶纯化后用 2 根 QIAquick 柱（适配 70 bp–10 kb），每柱 35 μL EB 洗脱（共 105 μL），定量。
5. 按配方③用 NEBuilder HiFi 于 50°C 组装 60 min，0.8× SPRIselect 纯化（160 μL 珠 + 200 μL 反应，室温 5 min；磁架上弃上清，500 μL 80% 乙醇洗 3 次，20 μL EB 洗脱）。
6. 电转转化：25 μL Endura Duo 感受态 + 1 μL 组装产物（>50 ng），0.1 cm 杯、Ec1 程序（1.8 kV 单脉冲）；立即加 2 mL SOC，共做 2 管，37°C 250 rpm 摇 1 h。
7. 取 2 μL 菌液按 2000×、10000×、20000× 稀释，各涂 50 μL LB 板过夜。次日数克隆，要求总克隆数 ≥ 每 sgRNA 1000 个克隆（按 2 mL 菌液计）。总克隆数 = 单板克隆数 × 稀释倍数 × 菌液总体积（约 4000 μL）/ 涂板体积（50 μL）。
8. 取约 4 mL 菌液接入 300 mL 新鲜 LB（含 150 μg/mL 氨苄），37°C 200 rpm 摇 16 h。
9. 收菌，用 Zymo Midiprep 提质粒，多次以 200 μL 洗脱 buffer 洗脱并合并，保证质粒浓度 >1 μg/μL；过无内毒素柱后再测终浓度。

步骤 2：sgRNA 批量测序（文库 QC）

在三个节点各测一次 sgRNA 覆盖：质粒文库、感染后的细胞基因组 DNA（gDNA，>200 万细胞或 1000× sgRNA 数，DNeasy 提取）、分化第 8 天的 gDNA。目的是确认全程没有明显的 sgRNA drop-out 或异常富集。

1. 按配方④做 PCR-1；合并反应后两步 SPRIselect 纯化：先 0.6×（60 μL 珠 + 100 μL）去除 >800 bp 片段，取上清再加 60 μL 珠，80% 乙醇洗 3 次，40 μL EB 洗脱。
2. 按配方⑤做 PCR-2 加 index；0.7× SPRIselect（70 μL 珠 + 100 μL）去大片段，上清再加 30 μL 珠，乙醇洗 3 次，35 μL EB 洗脱 275 bp 产物；Qubit + TapeStation 定量质检。
3. 纳米孔测序（可选快捷路线）：按 Ligation Sequencing Amplicons – Native Barcoding Kit 24 V14 操作，仅改三处——End-prep 加 19 μL（原 15 μL）AMPure XP；条码连接步骤用 1.0×（原 0.4×） beads；接头连接清洗步骤加 50 μL（原 20 μL）beads。上 MinION 或 PromethION。

步骤 3：慢病毒包装

用 HEK293T 包装、超离浓缩 sgRNA 慢病毒。

1. 转染前 24 h 铺 HEK293T 细胞至合适密度。
2. 按配方⑧配 DNA 混合液（按皿数等比放大），每皿加 Opti-MEM 1 mL 混匀；每皿加 64 μL Transporter 5，涡旋 5 s，轻离。室温静置 20 min，轻柔吹打 3 次后逐滴加到细胞上，晃匀。次日换液。
3. 换液后 48 h 收毒：超离机预冷至 4°C；含毒上清用注射器经 0.45 μm 滤膜过滤。
4. 浓缩：滤液分装超离管（25–30 mL/管，不足用 DMEM 补），SW28 转子 25000 rpm、4°C、90 min；弃上清，用适量 mTeSR Plus + CloneR2 完全培养基重悬。
5. 病毒新鲜使用滴度最高；4°C 可存 3 天，长期分装 −80°C。

步骤 4：dCas9-KRAB ESC/iPSC 的 sgRNA 文库感染

先测滴度，再按目标 MOI 感染。常规 MOI ≤0.3 实现「每细胞一条 sgRNA」；大文库（如全 TF 组）建议 MOI≈3，对应每细胞 2–4 条 sgRNA——只有当 sgRNA 效率偏低（靶向非编码区）或部分靶基因在该细胞类型中不发挥功能时，才用高 MOI 补偿。

1. 单细胞消化 PSC：吸培养基，PBS 洗一次；加 TrypLE Select 1 mL，37°C 孵育至多 15 min（每 3 min 镜检，细胞变圆、拍板可脱落即可）；吹打散细胞，4 mL PBS 中和；300 g×5 min 离心，重悬于 mTeSR Plus + 10 μM Rock inhibitor，充分吹散细胞团，再 300 g×5 min，按用途重悬。
2. 测滴度（以 H9/WTC11 为对象）：细胞养至 80% 汇合（约 200 万/孔）；感染前 4–5 h 换含 CloneR2 的培养基。按单细胞悬液流程消化，重悬于 1 mL 培养基 + 10 μM Rock inhibitor；计数，活率 <80% 则重洗，仍 <80% 不继续。每条件分装 100 万细胞，300 g×5 min 去上清，按 100 万/mL 重悬于培养基+CloneR2，转入 6 孔超低吸附板；分别加病毒 10 μL、50 μL、200 μL 作为梯度起点；37°C/5% CO₂ 孵育。
3. 3 h 后把细胞转入新铺 Matrigel 的 6 孔板（补 1 mL 培养基+CloneR2）；次日换 mTeSR Plus。
4. 2 天后测滴度：消化细胞，按约 1000 万/mL 重悬，流式测 BFP+ 比例≈该条件 MOI（若病毒被其他荧光通道稀释 10 倍，实际 MOI 要乘 10）。全规模感染所需病毒量按 4°C 存放 2 天约损失 10% 感染力折算。
5. 全规模感染：流程同滴度测定，但感染 3 h 后把所有孔合并、用培养基+CloneR2 稀释到 50 万/mL，每孔 2 mL（100 万细胞）铺到新 Matrigel 6 孔板；次日换液，继续培养。
6. 红线（出现即终止实验）：活率 <50% 或低到无法维持文库复杂度；细胞状态异常；标记荧光显著低于预期。首次传代前拍代表性照片估算整合效率。

步骤 5：FACS 分选 BFP+ 细胞

用 sgRNA 构件自带的 BFP 报告基因富集感染成功的 PSC。

1. 按单细胞悬液流程制备细胞，重悬于培养基+Rock inhibitor 至约 1000 万/mL；同时给接收用的 15 mL 离心管预加 2 mL 培养基+Rock inhibitor 润湿管壁。
2. 细胞经 40 μm 滤网滤入上样管，FACS 分选 BFP+ 群体，收集进备好的 15 mL 管。
3. 300 g×5 min 离心去上清，重悬于培养基+CloneR2+Normocin，按 100 万/孔铺 6 孔板；分选 2 天后换回完全 mTeSR Plus。
4. 之后每 1–2 天换液、按需传代，传代全程注意维持细胞文库复杂度。感染后 2 周开始心肌分化。

步骤 6：分化为心肌细胞（GiWi 法）

用 CHIR99021 / Wnt-C59（GiWi）时序调控 Wnt 信号，把 PSC 高效分化为心肌细胞。

• Day 0：现配 CDM3-C——CDM3 完全培养基中加入 CHIR99021 至终浓度 3–4 μM，37°C 预热；吸旧液，每孔加 5 mL CDM3-C。
• Day 2：现配 CDM3-C59——CDM3 完全培养基加 Wnt-C59 至 2 μM，预热；48 h 时吸旧液加 5 mL。
• Day 4、Day 6：吸旧液，各加 5 mL CDM3 完全培养基。
• Day 8、Day 10：换选择培养基（RPMI+B27），每孔 2 mL。
• Day 8 插入 QC：取少量分化中细胞提 gDNA，按步骤 2 做纳米孔 sgRNA 覆盖度测序——确认没有大规模 sgRNA 富集/丢失再继续。
• Day 12 收获心肌细胞：每 6 孔加 10× TrypLE 1 mL，37°C 消化 1 h；配重悬液（RPMI+B27+10% KOSR+Rock inhibitor），轻柔吹打 8–10 次把心肌细胞打散成单细胞；1500 rpm×5–7 min 离心，弃上清重悬，计数备用。

注意：每个 PSC 系的 CHIR99021 最适浓度和接种密度都不同，正式筛选前必须用小规模实验优化（见 Troubleshooting 3）。

步骤 7：细胞 hashing

用 12 色 TotalSeq Hashtag 抗体给不同来源细胞贴条码，混合后超量上机，把 scRNA-seq 成本摊薄：每库回收 6 万细胞（试剂盒标称 2 万）。

1. 把收获的心肌细胞制成单细胞悬液，取 1000–1300 万细胞重悬于 1 mL 染色 buffer（1% BSA 的 PBS/培养基 1:1 混合液），置于 1.5 mL EP 管。
2. 冰上在 200 μL PCR 管中把 1 μL（0.5 μg）Hashtag 抗体用 5 μL 染色 buffer 稀释，12 种抗体逐一配制；每管加 50 μL 细胞悬液，混匀，4°C 旋转孵育 20 min。
3. 每管加 150 μL 染色 buffer，275 g 离心洗一次；去上清后再加 200 μL 染色 buffer，混匀后全部转入含 5 mL 染色 buffer 的 15 mL 管（冰上），275 g 离心。
4. 依次洗两遍：先 7 mL 冰预冷染色 buffer，再 7 mL 冰预冷 1% BSA/PBS；计数定容。
5. 用冰预冷 1% BSA/PBS 重悬至 500–600 万/mL，经 30 μm 预分离滤器过滤（去碎片、保留心肌细胞）；计数，活率须 >70% 且为单细胞悬液。
6. 上机量：心肌细胞每库上 17.3 万细胞（目标回收 6 万）；其他干细胞来源细胞上 11.5 万（同样目标 6 万）。

步骤 8：scRNA-seq 文库构建

按 10× Genomics CG000513 官方方案做三类文库，仅 sgRNA 文库做放大改造：

• 转录本文库：照 CG000513 Step 5（5′ Gene Expression Library Construction）执行，不改动。
• sgRNA 文库：照 CG000513 Step 6 执行，但 sgRNA cDNA 投入量放大 4 倍——6.1.j~6.1.m 步洗脱改 20.5 μL（原 40.5 μL）；6.2.b 步每 PCR 反应加 10 μL（原 5 μL）Guide RNA cDNA Cleanup、40 μL（原 45 μL）Feature S1 primers 4；6.2.e 与 6.4.d 步 PCR 循环从 10 增至 11。
• HTO 文库：照 CG000513 Step 7（Cell Surface Protein Library Construction）执行，不改动。TotalSeq Hashtag 试剂识别 CD298 与 β2 微球蛋白两种表面蛋白，适用于绝大多数人源细胞。
• Qubit 定量 + TapeStation 看峰大小。

步骤 9：高通量测序与数据分析

• 测序量目标：转录本文库 600 M reads；sgRNA 文库 140 M reads；HTO 文库 60 M reads。
• 用开源管线 Pyspade（GitHub：Hon-lab/Perturb-Seq-Processing-Pipeline）处理 Fastq：从比对、细胞- sgRNA 归属到最终转录组输出，支持查看特定扰动下的差异表达基因（DEG）并做生物学解读。

注意事项（贯穿全程）

• 复杂度优先：从电转克隆数（每 sgRNA ≥1000 克隆）到感染后传代，每个环节都以维持文库复杂度为第一目标；任何一步掉复杂度，后面全部白做。
• 三个 sgRNA 覆盖 QC 节点不可省：质粒文库 → 感染后 gDNA → Day 8 分化中 gDNA；纳米孔改造方案（3 处 beads 用量调整）是为了提高短扩增子回收。
• PSC 极怕单细胞操作：消化和 FACS 前都用 CloneR2 预处理数小时，活率要求 80%（感染前）/70%（hashing 后）是硬门槛。
• MOI 选择看文库规模：小文库低 MOI（≤0.3）追求单 sgRNA/细胞；全 TF 组等大文库用 MOI≈3（2–4 条/细胞）。
• 慢病毒产毒、超离与感染请遵守所在机构 BSL-2 生物安全与 SCRO 审批规范。

Troubleshooting

1. 步骤 4 感染后细胞大量死亡	病毒滴度过高会杀死 PSC。务必精细测滴度，用低/中 MOI 感染，保住细胞健康。
2. 步骤 5 单细胞消化/FACS 后细胞死亡	PSC 对单细胞操作极其敏感。分选前几小时加 CloneR2 预处理，可显著提高活率与分选后恢复。
3. 步骤 6 心肌分化效率低	每个 PSC 系都要单独优化。通常是 CHIR99021 浓度随细胞系和起始密度变化，组合测试即可找到窗口。
4. 步骤 6 收获时心肌细胞离不下来	心肌细胞易互粘。10× TrypLE 37°C 消化 1 h + 吹打即可打散；不够就延长 TrypLE 时间。
5. 步骤 9 测到不带 sgRNA 的细胞	多因未做抗性筛选或 sgRNA 捕获效率低：感染后务必用慢病毒携带的抗性标记筛选；scRNA-seq 前确认分选对象携带 sgRNA（BFP+）；大规模实验前先优化 sgRNA 捕获。

预期结果

文库内置三层对照：非靶向 sgRNA（不压制基因组任何区域）、特异性压制靶基因但不改变分化的阳性对照、靶向心肌特异基因的 sgRNA（已知压制后会改变心肌分化）。流程跑通时的判读标准：

1. 非靶向 sgRNA 组的心肌细胞上调心肌标志物（如 Tnnt2）；
2. 阳性对照 sgRNA 组：靶基因被压制，且心肌标志物正常上调；
3. 心肌特异基因 sgRNA 组：靶基因被压制，且回收到下游差异表达转录本。

三层对照共同验证流程的生物学与技术环节，测试基因压制的输出结果即可在此基础上解读与深挖（示例输出见原文方法学论文 Sivakumar et al.）。

局限性

• Perturb-Seq 擅长找发育过程不同时点的调控因子，但导致细胞死亡的扰动会从筛选中丢失，促进增殖的扰动则会在细胞数上被富集——因此全程监测 sgRNA 覆盖度至关重要，才能保证筛选后各扰动的细胞数均一。
• Perturb-Seq 适合研究细胞自主（cell-autonomous）效应；非细胞自主效应在单细胞扰动框架下较难捕捉。

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来源：Sivakumar et al., STAR Protocols 7(3), 2026。开放获取（CC BY-NC-ND 4.0）。