microCT 时序配准：把两次扫描叠出一张 3D 骨重塑动态图
Protocol for 3D digital dynamic histomorphometry of mouse bone via time-lapse registration of serial microCT scans
- 作者：Q. A. Meslier, N. Migotsky, S. N. Lamia, E. L. Scheller, M. J. Silva（华盛顿大学圣路易斯分校，Silva 实验室）
- 期刊：STAR Protocols（Cell Press）｜发表日期：2026-08-25
- DOI：10.1016/j.xpro.2026.104787｜PMC：PMC13543904
- 代码与宏：GitHub 仓库 3D-digital-dynamic-histomorphometry（Zenodo 存档）
一句话总结
体内 microCT 本来只能看骨头"某一时刻长什么样"，这套方案教你把干预前（Pre）和干预后（Post）两次扫描做图像配准（对齐叠加），在三维空间里逐一体素标出"哪里长出新骨、哪里被吸收、哪里没动"并定量——不做硬组织切片，也能拿到"3D 数字版动态组织形态计量学"数据。
亮点
- 成骨与骨吸收同时定量：经典荧光双标动态组织形态计量学只能量化骨形成，量不了吸收；本方案在同一标本上一次性标出形成、吸收、静止三类区域；
- 零代码、拖拽式：全程基于 Dragonfly 交互软件图形界面，既往要写自定义脚本才能做的时序配准，现在点击式操作完成；
- 验证扎实：与金标准荧光标记区域高度一致；两名操作者各配准 3 次，组内变异系数 < 0.24%、组间差异 < 0.11%；
- 可扩展：可选 MATLAB 渲染与 BoneJ 厚度定量，进一步给出 3D 矿化沉积率（MAR）和吸收率（MRR）。
开始之前（Before you begin）
机构许可
动物实验须符合机构指南并获得 IACUC 批准。示例条件：C57BL/6J 雌鼠群养，22–25°C、12 h 明暗交替，自由饮水采食（Purina 5053）。开始任何操作前先拿到动物伦理批准。
准备：体内扫描
耗时：每次约 15 min（213 层、10.5 μm/voxel，Scanco vivaCT 40；扫描参数 70 kVp、114 μA、300 ms 积分）。
- 干预前采集目标骨（如胫骨）扫描（Pre-Scan），实验终点用完全相同参数重扫（Post-Scan）；
- 两次扫描必须覆盖同一骨区域：用解剖标志点（生长板、胫腓连接等）保证窗口一致；
- 扫描后立即按统一 QC 标准目检重建图像：无运动伪影、无模糊、ROI 覆盖完整、无层间错位、皮质边缘锐利、无双重轮廓或运动条纹；
- 合格后全部以 DICOM 导出。
关键（CRITICAL）：运动伪影和拖影会显著降低配准精度，直接破坏定量结果，伪影明显必须重扫；Pre/Post 扫描覆盖区还必须有足够重叠，否则感兴趣区无法配准。
关键资源
| 类别 | 内容 | 来源 | 标识符 |
|---|---|---|---|
| 实验动物 | 小鼠（示例 C57BL/6J；另含 8 个近交系创始人品系），20–22 周龄，雌雄皆可 | The Jackson Laboratory | IMSR_JAX:000928 等 |
| 软件（主平台） | Dragonfly 2024.1 | Object Research Systems (ORS) | SCR_025150 |
| 软件（可选） | MATLAB R2024b（3D 渲染与扩展参数） | MathWorks | SCR_001622 |
| 软件（可选） | Fiji (ImageJ) + BoneJ 插件（沉积/吸收速率） | 开源 | SCR_002285 / SCR_018166 |
| 硬件 | i7-14700K、128 GB 内存、RTX 4070 GPU（12 GB）、Windows 11 64 位 | 自配 | — |
Dragonfly 对硬件有要求，安装前查阅官方 system requirements 页面。
分步方案
步骤 1–9：导入扫描数据（5 min）
- "File" → "Import DICOM Images"；
- "Folder Content Tab" → "Open Folder"，选择 DICOM 文件夹 → "Ok"；
- 点 Scan info 高亮 → "View Study"；
- 双击数据集重命名为
PreScan_ScanNbr（ScanNbr 按实验编号替换）； - 对 PostScan 重复，命名
PostScan_ScanNbr。
注意：导入后两个扫描应出现在 "Data properties and Settings" 面板；随手保存 ORS session。本方案基于 16 位 DICOM 开发验证，8 位虽可导入但未经正式验证，低位深可能降低对比度、影响定量。
步骤 10–12：建掩膜并去除背景（5 min）
- 只显示 PreScan_ScanNbr（眼睛图标），确保没有其他数据集可见；
- 进入 "Segment Tab"，勾选 "Define Range"，点 "Upper Otsu"——应只有骨头变红（切勿连点多次，误点后 "Selected Range" 下 "Reset"；异常见 Troubleshooting 1）；
- 记录 Upper Otsu 阈值数值（后面还要用）；"Add to New" 生成新 ROI，取消 "Define range"，重命名
PreROI； - "Morphological operations" 设膨胀参数：Dimensionality
2D (Z)、ShapeCircle、Kernel Size15（近端胫骨用 11），依次 "Dilate"、"Smooth"； - 右键 PreROI → "Modify and Transform" → "Invert"，勾 "Invert Values" + "Create New DataSet"，得
PreROI(Inverted)：此时背景被掩膜、骨头不被掩膜，可手动补笔确保骨像素不被盖、背景噪声全被盖； - 保持选中，"Image Operations" 下拉选 PreScan_ScanNbr，"Overwrite" 输入
-3000（可调，必要时低至 −20000）→ OK； - 对 PostScan 重复全部操作，命名 PostROI / PostROI(Inverted)。
参数解读：膨胀的目标是"尽量去背景、骨表面留一圈薄背景"。皮质骨用 2D 圆核 15 像素；小梁骨等复杂几何建议 11 像素，可按骨几何、体素大小和图像质量自行调整。
步骤 13：质心对齐（1 min）
右键 PostScan_ScanNbr → "Align" → "Centroid With…" → 选 PreScan_ScanNbr → OK。质心对齐后尚未完成配准。方案假设两次扫描样本朝向相近；朝向差异大时先手动校正（见 Troubleshooting 2）。
步骤 14：图像配准（10 min）
"Utilities" → "Open Plugins" → "Image Registration"，设置：Fixed = PreScan_ScanNbr，Mobile = PostScan_ScanNbr；Register using = "Rotation, Translation"；Interpolation = "Linear"；Method = "Mutual information"。然后分三段由粗到细迭代：
| 配准阶段 | 旋转初始步长 | 旋转最小步长 | 平移初始步长 | 平移最小步长 |
|---|---|---|---|---|
| 粗配准（Coarse） | 10 | 0.5 | 0.15 | 0.011 |
| 中间配准（Intermediate） | 5 | 0.01 | 0.1 | 0.01 |
| 精配准（Fine） | 5 | 0.01 | 0.1 | 0.001 |
每阶段点 "Apply" 后检查 "Registration information"：反复执行至互信息（Mutual Info）在箭头两侧接近、旋转与平移值趋近 0，再进下一阶段。旋转/平移不必强求恰为 0，但应足够小且稳定。参数为 10.5 μm 体素经验优化值；其他体素可按"粗配准最小平移步长 ≈ 1 个体素"的原则调整。
步骤 15（可选）：宏自动配准（10 min）
- 从 GitHub 下载宏
Meslier_RegistrationMacro，放入C:\Users\用户名\AppData\Local\ORS\Dragonfly2024.1\pythonUserExtensions\Macros（找不到 AppData 就 Win+R 输%LocalAppData%）； - 必要时重启 Dragonfly（先存 session）；完成步骤 1–14 后，Utilities → Macro Player 选该宏 → "Play Next Step"；
- 宏暂停时下拉选 PreScan（fixed）/ PostScan（moving）→ "Play All Steps" 跑完；
- 跑完仍须手动复核互信息、旋转、平移（步骤 14.e），不合格按 Troubleshooting 4 精修。
步骤 16：建配准后掩膜（<5 min）
高亮 PreScan_ScanNbr → 勾 "Define Range"（阈值用步骤 11 记录的同一 Upper Otsu 值）→ "Add to New" → 重命名 PreBone，Circle / 2D (Z) / Kernel 3 平滑；对 PostScan 重复得 PostBone。小核平滑为降噪同时保住骨几何；更大核或 3D 平滑可能过度抹平细节，自行权衡。
步骤 17–18：重采样与裁剪（<5 min）
- PostBone 在另一图像空间，须重采样：右键 PostBone → "Modify and Transform" → "Resample Geometry" → 选 PreScan_ScanNbr → OK，得
PostBone (Resampled)； - 裁掉不重叠区（两扫描窗口略有不同时会存在）：显示 PreBone、PostBone (Resampled) 和 PreScan_ScanNbr，高亮 PreScan（保证切片号以它为准）；横断面滚动找出两掩膜起止重叠的 z 切片号；右键 PostBone (Resampled) → "Crop" 输入起止切片，勾 "Create New" + "Apply to other" → Apply；只留两个骨掩膜，Ok、Close。
步骤 19：去伪影（<5 min）
灰度与骨接近的伪影可能在阈值化时混进掩膜：右键 "PreBone (Cropped)" → "Refine Region of Interest" → "Process Islands" → "Keep by largest 26 connected" → 输入 1 → OK；对 "PostBone (Resampled) (Cropped)" 重复。此步只保留最大连通域（骨本身）。
步骤 20：定义骨形成 / 吸收 / 静止区（<5 min）
- 点
PreBone (Cropped)，Ctrl+点PostBone (Resampled) (Cropped)："Intersect" → 静止骨 Q；"A-B" → 骨吸收 R； - 点
PostBone (Resampled) (Cropped)，Ctrl+点PreBone (Cropped)："A-B" → 骨形成 F。
步骤 21（可选）：去胫骨嵴（<5 min）
胫骨前嵴易干扰表面定量，可从 F、R、Q 掩膜擦除：选中掩膜 → "ROI painter" 的 "2D view tools" 勾 "multi-slice"，选方形画笔、下拉 "Full"；横断面从第一层开始，Ctrl+滚轮调画笔，尖端 Shift+点击擦除，滚动到掩膜重现处重复，直到层堆顶部；对 F、R 重复。
步骤 22–27：骨内膜 / 骨外膜表面特异定量（5 min）
某些干预只作用于骨外膜、不影响骨内膜，表面特异定量因此必要。
- Pre 骨髓腔：选 "PreBone" → "Modify and Transform" → "Invert…"，勾 "Invert values" + "Create new"；新掩膜 → "Refine Region of Interest" → "Process Islands" → "Remove by largest (26-connected)"；重命名
Marrow Pre（髓腔与外界经血管连会被"连坐"，见 Troubleshooting 5）； - Post 骨髓腔：对 "PostBone" 重复，得
Marrow Post； - 骨内膜：Marrow Pre Ctrl+点 Marrow Post → "A-B" →
Endo_F；Marrow Post Ctrl+点 Marrow Pre → "A-B" →Endo_R； - 骨外膜：F Ctrl+点 Endo_F → "A-B" →
Perio_F；R Ctrl+点 Endo_R → "A-B" →Perio_R； - 在 "Statistical Properties" 高亮 "Volume"，把 F、R、Endo_R、Endo_F、Perio_F、Perio_R、Q、PreBone 逐个抄进表格；
- 保存 ORS session。主配准流程到此完成。报告建议用形成骨（或吸收骨）占 PreBone 的比值（F/BV、R/BV）。
步骤 28–38（可选）：MATLAB 渲染与扩展参数（25 min）
提供 3D 渲染及额外参数（3D 矿化/侵蚀表面、3D 骨形成与吸收速率），只需基础编程能力：
- Dragonfly 导出二值掩膜：右键掩膜 → "Export" → "ROI as binary"，tiff 格式、勾 "Output as one file"；对 R、Q、WB、PreBone、Endo_F、Endo_R、Perio_F、Perio_R 重复；
- 建目录：Samples → 样本号文件夹（如 624）→ Mid（中段；近端建 Proxi）→ 放入 tiff 掩膜；
- GitHub 下载
Meslier_3DDynamicHisto_QM.m在 MATLAB 打开；改第一节的样本文件夹路径、文件夹编号、Pre/Post 间隔天数、分析区域（Midshaft/Distal/Proximal）、XY 与 Z 体素大小； - 下载结果模板
Meslier_Results_3DDynamicHisto_template.xlsx，第一表填组名与样本号，另存 Copy 并关闭，脚本第 22 行改其路径； - Run 运行；检查自动质检图：逐层形成/吸收像素数曲线、周长曲线（胫骨应平滑渐变；局限少数层的尖峰提示分割错误）、绿色表面逐一检查图、掩膜叠加图、3D 渲染；
- 所有样本重复；结果同时打印在命令窗口，可手动誊录。
步骤 39–48（可选）：BoneJ 定量 MAR 与 MRR（10 min）
用 BoneJ "Thickness" 量化形成/吸收骨厚度，除以扫描间隔天数即得 3D 矿化沉积率（MAR）/吸收率（MRR）。无需编程（BoneJ 先按 bonej.org 装入 Fiji）：
- 导出二值掩膜（同步骤 28）：R、Q、Endo_F、Endo_R、Perio_F、Perio_R；
- Fiji 打开掩膜 → "Plugins" → "BoneJ" → "Thickness"，勾 "Trabecular thickness"、"Show thickness maps"、"Mask thickness maps" → OK（选项虽叫小梁厚度，实际量的是皮质周围形成/吸收区厚度）；
- 检查厚度图（厚=浅黄、薄=紫），结果表自动给出平均厚度；
- 平均厚度 ÷ Pre/Post 间隔天数 = 3D 矿化沉积率；对吸收掩膜重复得吸收率。
预期结果
完成本方案后可获得精确配准的 Pre/Post μCT 数据集，在小梁骨与皮质骨的骨内膜、骨外膜表面定量形成、吸收、静止区域：
| 参数 | 含义 | 单位 |
|---|---|---|
| F/BV | 形成骨体积占总骨体积比 | % |
| R/BV | 吸收骨体积占总骨体积比 | % |
| MS（可选） | 矿化表面 | % |
| ES（可选） | 侵蚀表面 | % |
| BFR/BS（可选） | 单位骨表面骨形成速率 | μm³/μm²/day |
| BFR/BV（可选） | 单位骨体积骨形成速率 | %/day |
| BRR/BS（可选） | 单位骨表面骨吸收速率 | μm³/μm²/day |
| BRR/BV（可选） | 单位骨体积骨吸收速率 | %/day |
| MAR（可选） | 矿化沉积率 | μm/day |
| MRR（可选） | 矿化吸收率 | μm/day |
方法学验证：配准 μCT 得到的骨外膜骨形成与金标准 2D 荧光动态组织形态计量学对比，形成区域一致（黄箭头对应）；荧光缺失区恰与 μCT 配准发现的吸收区吻合（白三角）。重复性：两名操作者对同一数据集各配准 3 次，F/BV 与 R/BV 组内变异系数均 < 0.24%、组间差异 < 0.11%。
相对传统切片的优势：可在远大于单张组织切片的 ROI 内做三维形成/吸收可视化与定量，并支持骨内膜/骨外膜/联合表面分别定量；可选 MATLAB 工作流输出更直观的 3D 渲染。
局限性
- 依赖配准质量：体位差异大、噪声高、运动伪影多或解剖结构本身改变时精度下降；自动宏跑完仍需人工校验，配准不全直接波及布尔运算准确性；
- 阈值化掩膜天生短板：灰度接近矿化组织的伪影可能被误纳入，须人工清理；不同仪器/研究的扫描质量与参数差异影响可比性。扫描分辨率决定可解读的最小形成/吸收量，低于该尺度的变化不能下结论；
- 对称骨更难配准：如股骨中段缺乏不对称解剖标志，建议把大转子等标志纳入 ROI；
- 重复辐射的考量：依赖重复体内 μCT，辐射剂量、扫描频率与恢复间隔可能影响骨结构本身，实验设计必须权衡；
- 测的是矿化组织而非细胞活动：μCT 看不到类骨质等未矿化早期骨形成，结果反映净矿化骨动态；需细胞层面解读时建议辅以组织学验证。
Troubleshooting
| 问题（步骤） | 现象 | 解决方案 |
|---|---|---|
| 1. Upper Otsu 阈值异常（步骤 11） | 连点多次得错误阈值；背景伪影被纳入阈值范围 | 删掉重新导入 DICOM，或用记录值手动改回；伪影多时手动微调阈值，或保留 Upper Otsu 后用 ROI painter 抹掉伪影 |
| 2. 质心对齐失败（步骤 13） | Pre/Post 初始朝向差异过大，配准失败 | 先粗手动对齐：选 Post-Scan，"Main" → "Translate/Rotate" → "Displace"，在横断面用平移/旋转大致对齐（3D 视图检查）再配准 |
| 3. 配准插件数值改不了（步骤 14） | 窗口弹出后无法手动改参数（软件小故障） | Fixed/Moving 互换一次再换回（恢复 PreScan=Fixed），即可恢复 |
| 4. 自动宏效果不佳（步骤 15） | 困难样本对不齐，互信息指标不一致 | 从步骤 15.h 起手动运行 Image Registration 插件，迭代至互信息、旋转、平移达标 |
| 5. 骨髓腔定义被"连坐"（步骤 22） | 髓腔经血管与骨外空间连通，"Remove by largest" 把髓腔连同外界一起删掉 | ROI painter 橡皮擦手动断开连通（单层连通用 "single slice"，Shift+滚轮调画笔，Shift+点击擦除血管）再重跑 |
资源可用性
- 通讯作者：Matthew J. Silva（silvam@wustl.edu）；技术联系人：Quentin A. Meslier（meslier@wustl.edu）。
- 数据与代码：MATLAB 脚本与 Dragonfly 宏开源（GitHub：3D-digital-dynamic-histomorphometry；Zenodo DOI: 10.5281/ZENODO.19225261）。
- 未产生新的独特试剂。
本文为中文编译版，供方法学习参考，引用请注明原始出处。