明胶平台法冷冻切片：让 0.1–2 mm 小样品也能做出高分辨率 MALDI 质谱成像
原文：Mokosch AS, Müller MA, Garmendia Sanchez L, Gerbig S, Spengler B. STAR Protocols（2026），DOI: 10.1016/j.xpro.2026.104789，PMC13542592（德国吉森尤斯图斯-李比希大学 Spengler 实验室） 本文为中文编译版，供方法学习参考，引用请注明原始出处。
一句话读懂这篇 Protocol
质谱成像（MALDI-MSI）能给组织拍出"分子地图"，但一碰到 0.1–2 mm 级别的小样品——比如曼氏血吸虫成虫、果蝇脑——常规包埋和切片就崩溃了：样品太小，没法在切片过程中重新定位，一不留神就切偏、切碎、漏切。这篇方案的核心改进是在自制螺丝样品台上先做一个明胶平台（gelatin plateau）：把 20 μL 明胶滴在磨平的螺丝头上冻住、削出一个平面，样品直接放在平台上再覆一层明胶——方向可控、样品几乎零损耗，还能一次并排放两个样品直接对照。从样品收集、冷冻切片、基质喷涂、AP-SMALDI 高分辨率采集到 Mirion 数据可视化，完整走通"小而脆"样品的空间脂质组/代谢组分析。
方案亮点与创新点
- 明胶平台 + 螺丝样品台：替代昂贵的商用样品台——一颗磨平顶的 M6 圆柱螺丝（顶部直径≥5 mm）即可；平台保证样品朝向正确，在目标切面上能切出更多有效切片。
- 零浪费切片：常规方法刀片切不到样品台边缘，小样品总会剩下"切不到"的部分；平台上操作可以完整切穿整个样品，对小样品意味着保住可观的检测比例。
- 双样品并排：平台够大时（30 μL 明胶）可同时放两个样品，同一切片直接对照。
- 无需化学固定：样品保持近原生状态，形态与化学组成同时保留，单次测量即可获得数百种分析物（脂质、代谢物、药物分子）的半定量空间分布。
- 两个难度不同的示范样品：血吸虫成虫代表"小而韧"，果蝇脑代表"极脆"，均给出针对性操作细节，方便迁移到其他难处理样品。
开始之前
机构许可
曼氏血吸虫（S. mansoni）饲养需要脊椎动物宿主，相关实验必须获得机构批准（原文实验经德国吉森区政府批准，批号 V54-19 c 20/15 h 02 GI 18/10 Nr. A 14/2017）。本文所用形式的果蝇成虫、果蝇脑及血吸虫成虫不具备感染或致伤风险，但仍需按具体样品类型选择防护措施。
背景速览
- 生命科学对 0.1–2 mm 尺度小样品的高分辨测量需求持续增长，典型对象包括寄生虫（血吸虫）与小型模式动物（果蝇）等。
- 小样品研究对药物开发尤其有价值：MALDI-MSI 可直接观察候选药物在虫体内的摄取与空间分布，服务代谢研究与药物筛选。
- 本方案使用 AP-SMALDI5 AF 离子源（激光斑 <5 μm）耦合 Q Exactive HF 质谱，空间分辨率是小样品分析的关键。
安全须知（节选）
| 危险源 | 要点 |
|---|---|
| 液氮 | 严防冻伤，穿戴防护手套；蒸发会降低氧浓度，务必通风良好，必要时配氧传感器 |
| 干冰 | 防冻伤；升华产生大量 CO₂，只在通风处使用，注意地面沉积风险 |
| 冷冻切片机 | 刀片极锋利，清洁时戴防割手套；−20 至 −25°C 作业防冻伤 |
| MALDI 质谱 | 离子源含两支 4 类激光；开放系统必须佩戴激光防护镜并限制人员进入 |
关键资源与材料（节选）
| 类别 | 内容 | 来源 / 标识符 |
|---|---|---|
| 化学试剂 | 明胶（Cat#24360.233）、DHB 基质 2,5-二羟基苯甲酸（Cat#8.41745.0050）、TFA（Cat#1.08262.0025）、PBS（Cat#9143.2）、戊二醛 25%（Cat#G5882）、HPLC 级水、丙酮 | VWR / Merck / Carl Roth |
| 实验模型 | 曼氏血吸虫成虫合抱体（liberian 株） | 吉森大学 Grevelding 实验室 |
| 实验模型 | 果蝇野生型 | 牛津大学 Miesenböck 实验室 |
| 主要设备 | AP-SMALDI5 离子源、Q Exactive HF 质谱、Microm HM 525 冷冻切片机、SMALDIPrep 喷雾仪、VHX-5000 数码显微镜 | TransMIT / Thermo Fisher / Keyence |
| 耗材 | M6 圆柱螺丝（内六角，顶部磨平，Cat#912-2-6x16/200）、PTFE 印刷玻片、羽毛镊（Cat#GF041）、玻片邮寄盒、载玻片、玻璃刀 | Schraubenhandel / EMS / Faude |
| 软件 | Mirion 3D、SMALDIControl v1.6、MatrixSprayer v1.39、Tune 2.11 | TransMIT / Thermo Fisher |
完整试剂清单（含目录号）见原文 Key Resources Table。
材料与配方
DHB 基质溶液（1 mL）：DHB 30 mg（终浓度 30 mg/mL）+ TFA 1 μL（终 0.1 vol%）+ 水 500 μL + 丙酮 500 μL（水：丙酮 = 1:1, v/v）。
戊二醛-PBS 溶液（1 mL，每次取样现配）：PBS 736 μL + 25% 戊二醛 264 μL（终浓度 6.6%），漩涡混匀。
明胶溶液 8 wt%（约 42 mL，血吸虫用）：明胶 3.7 g + HPLC 级水 42 mL。
明胶溶液 5 wt%（约 45 mL，果蝇脑用）：明胶 2.5 g + HPLC 级水 45 mL。
明胶浓度是切片质量的关键变量，必须按样品优化：浓度过低（3 wt%）会在样品周围形成液态薄膜，导致代谢物从组织渗漏进明胶；浓度过高（12 wt%）会在切片时使组织碎裂。血吸虫最优 8 wt%，果蝇脑最优 5 wt%。
分步方案
阶段一：样品台制备（耗时 1 h）
1选一颗顶部平整的螺丝（如 M6 内六角圆柱头螺丝，直径约 5–7 mm）。
2用细金属锉把螺丝顶部螺纹磨平，得到直径至少 5 mm、无明显划痕的均匀平面。
3在螺丝头上用记号笔或刻划做标记，之后装切片机时保持同一朝向。
阶段二：明胶溶液配制（耗时 3 h）
4按样品需要配制 5–10 wt% 的明胶水溶液（参考上文配方与优化建议）。
5完全溶解明胶：50–60°C 水浴加热，或超声浴约 1–2 h，直至完全溶解。
6分装到 2 mL 离心管，按需少量取用。
7−20°C 保存；用前温水浴复融至完全液化，复融后无需混匀。
阶段三：血吸虫样品收集（耗时 1 h）
8现配戊二醛-PBS 溶液（264 μL 25% 戊二醛 + 736 μL PBS，混匀）。
9标记载玻片（样品类型、取样日期、物种）。
10准备液氮杜瓦瓶和可浸入液氮的玻片支架。
11在标记玻片上滴 50–100 μL 戊二醛-PBS 溶液。
12用羽毛镊把活的血吸虫从培养液取出，放入玻片上的戊二醛溶液中。可以是合抱体或单条（雄/雌）；每张玻片约放 10 条处理方式相同的虫，数量可按样品类型调整。
13将玻片连虫浸入液氮数秒：完全没入；待戊二醛-PBS 溶液变白、液氮沸腾停止后取出。
14−80°C 保存待切片。
阶段四：果蝇脑样品收集（耗时 1 h）
15收集果蝇于培养瓶，置于冰上麻醉。
16在标准 PBS 中解剖出脑。
17在 PTFE 印刷玻片的一个孔内先加少量 PBS——避免脑直接粘在玻璃表面，否则无法摆正方向。
18用玻璃巴氏吸管轻柔吸取脑（绕吸管尖端吸入），转移入孔中。
19用解剖镊把脑在孔内摆到正确朝向。
20用小 tip 吸走孔内尽量多的 PBS。小心：动作务必轻柔，tip 不要直接碰到脑，防止脑粘到塑料表面；吸完确认脑仍在孔底且方向不变。
21立即用 3–5 μL 明胶覆盖脑。
22玻片浸入液氮数秒：完全没入，沸腾停止后取出。
23−80°C 保存，或干冰运输。小心：干冰可致冻伤，做好防护并保持通风。运输时把玻片放入玻片邮寄盒，玻片与盒盖之间垫一块软质材料（如软聚氨酯泡沫）防震动，再用胶带封盒防止途中开启。
阶段五：冷冻切片——制作明胶平台（耗时 0.5 h）
24把凝固的明胶管放入温水 5–10 min 复融。
25用移液器吸 20 μL 明胶溶液，滴在样品台顶面，形成半球形明胶穹顶。确保穹顶内没有气泡（见 Troubleshooting 问题 1）；若需要更大平台（比如同时切两个样品），可加到 30 μL。
26样品台放入冷冻切片机，−25°C 冷冻 5–10 min 至明胶冻透（变不透明即为冻透）（见问题 2）。
27把样品台固定到切片机夹具上，标记朝上。
28切片厚度设 50–100 μm，切削直至形成足够大的平坦明胶平台。
29用软毛刷清除刀片和平台上的碎屑。
30样品台留在切片机内备用。
阶段六：冷冻切片——转移血吸虫上平台（每个样品约 1 h）
31−80°C 保存的样品放干燥器室温回温约 10 min。
32同时在培养皿中放一张载玻片，滴约 100 μL HPLC 级水。
33离心管中的明胶若已凝固，温水复融。
34复融后用羽毛镊把一对虫放入玻片水滴中（见问题 3、4）。
35从切片机取出样品台，放在载玻片旁边。
36约 10 s 后把虫从水中夹出，用无尘纸尖端吸干表面多余水分。
37用镊子把虫放到明胶平台上：将镊子下臂抵住样品台螺纹固定，持虫的上臂轻触平台表面落虫。动作要快，防止明胶过热变软。
38样品台放回切片机 −25°C 冷却约 2 min，让虫牢固附着在平台表面。
39用移液器吸 20 μL 明胶（8 wt%），让液滴悬挂在 tip 侧面，小心罩到虫上方。
40样品台放回切片机，让明胶完全冻结（约 3–5 min）。
阶段七：冷冻切片——转移果蝇脑上平台（每个样品约 0.5 h）
41样品从 −80°C 取出，干燥器室温回温约 10 min。
42明胶若凝固，温水复融。
43用移液器把 20 μL 液态明胶（5 wt%）盖到脑上——不要打出液滴，也不要移开移液器。
44将 tip 靠近脑，把明胶吸回移液器，脑会随液滴一起进入 tip（见问题 5）。
45检查玻片，确认脑已成功进入移液器。
46在冷冻切片机内把含样品的明胶液滴放到明胶平台上，样品会沉向液滴底部。
47待明胶完全冻结（约 3–5 min）。
阶段八：冷冻切片——正式切片（耗时 1–2 h）
48把样品台夹回切片机，标记朝上。
49设定目标切片厚度（10–40 μm）。
50顺时针转动手轮切片。
51一开始切到的只有明胶；越接近样品，切片中会出现样品"印痕"。接近样品时先切测试片放到载玻片上，肉眼或显微镜确认是否已切到样品，避免错过。
52取片：将载玻片带标签一面朝下压向切片所在表面——拇指按住玻片左侧，右手缓缓把玻片下移至切片贴上玻片。同一张玻片要贴多张切片时，从第二张起改为拇指按右侧、缓缓下放左侧，避免压坏已贴好的切片（见问题 6）。
53每切一片，用软毛刷清理刀口和切割区。
54当只剩纯明胶切片时，样品已完全切穿。
55切片可立即使用，或 −80°C 保存。
阶段九：基质喷涂（耗时 1 h）
56称 30–60 mg DHB 直接装入 2 mL 离心管。基质浓度、用量、溶剂组成和喷雾流速都可按需调整。
57计算配成 30 mg/mL 所需溶剂量（1 mL 配方见"材料与配方"）：水与丙酮 1:1（v/v），加入 TFA 至终浓度 0.1 vol%。
58按计算量量取水、丙酮、TFA 加入 DHB 管。
59用 IKA MS3 数字振荡器彻底混匀。
60从冰箱取出切片样品，立即放入干燥器回温至室温约 30 min。
61用玻璃刀裁玻片，保留带样品的部分。
62用胶带把样品固定到 MALDI 靶板上。
63靶板装入 SMALDIPrep 喷雾仪样品架。
64注射器灌入新鲜配制的基质溶液。
65启动 SMALDIPrep 软件，按提示初始化各组件。
66应用模式选"HighRes"。
67选择预设方法或手动调参：DHB 基质，流速 5 μL/min，喷雾 30 min，氮气雾化 5 L/min（见问题 7、8）。最佳喷雾参数高度依赖基质、溶剂与样品类型，并受环境温湿度影响，复现时需自行微调。
68取出样品，显微镜下检查基质晶体大小是否合适、涂层是否均匀。
69立即测量，或常压条件最多存放 2 天——基质会保护分析物延缓降解。
阶段十：MALDI 测量（耗时 6–24 h）
70把带基质涂层的样品装入 MALDI 靶架。
71靶架插入 AP-SMALDI5 离子源。
72用 SMALDI 控制软件的自动对焦对准样品所在平面。
73通过在样品或周围基质层试射优化激光能量：在信号强度（质谱端）与烧蚀斑点大小（显微镜下观察）之间找平衡。
74用 SMALDIControl 圈选覆盖整个样品的矩形区域。
75步长设 5–10 μm，取决于所需横向分辨率与可用测量时间；所选分辨率应不大于仪器激光烧蚀斑点，避免过采样。
76平坦样品用标准 2D 模式；高度起伏明显的样品启用 3D 模式（测量中自动对焦）。
77在 Tune 软件设置方法参数（见下表）：
| 参数 | 数值 |
|---|---|
| Scan type | Full MS |
| 扫描范围 | 250–1,000 m/z |
| 碎裂 | 无 |
| 分辨率 | 240,000 |
| 极性 | 正离子 |
| Microscans | 1 |
| Lock Mass | 716.12461（DHB 簇 [5M+NH₄−4H₂O]²⁺） |
| 喷雾电压 | 3.00 kV |
| 毛细管温度 | 250°C |
| S-lens RF level | 100 |
扫描质量范围按目标分析物调整，不要超过 m/z 下限的 4 倍（避免离子分裂注入）；锁质按所用基质选择，位置尽量在测量范围中部。
78在 Tune 软件中输入文件名，包含样品 ID、日期、步长、x/y 像素数、质量范围与离子模式。
79Tune 软件点"Start"（见问题 9）。
80SMALDIControl 点"Measure"。
81测量完成后得到 Tune 的 raw 文件与 SMALDIControl 的 UDP 文件，用于后续成像与数据分析。
阶段十一：数据分析与可视化（耗时 2–4 h，Mirion 软件）
82启动 Mirion（mirion 3D V3.4.64.21）。
83"File → New Project"选择测量的 UDP 文件，点"Ok"确认。
84右键项目名 →"New Hypercube"创建超立方体（UDP 文件已定义 x/y 像素数与质量范围）。
85点"Ok"生成超立方体——需几分钟，它在内存中重排数据以便快速出图。
86侧栏选中超立方体，右键 →"New Histogram"。
87"width of bins/u"设为 0.004。
88点"Create histogram"生成直方图，完成后点"Accept"。
89侧栏选中直方图，右键 →"New Image"打开建图菜单。
90建图方式三种：自动（首次总览，生成最强信号图像，默认参数即可）；From List（已有候选分析物清单时，载入含 m/z 中值与质量窗口的列表定向出图）；以及按需调整参数的手动模式。
91点"Process Data"生成图像。
92浏览图像列表，点">"逐一挑选感兴趣的图像，或点">>"全选——只有这里选中的图像才能进入后续处理。
93点"ok"把选中图像转入 Mirion 主窗口。
94单图导出：点图像窗口的"Export Single Image"，在标准文件名中加入样品 ID。
95RGB 合成：选中一张图，右键 →"New Mastered Image"，用"Add"再加最多两张灰度图，用直方图滑块调节三色配比，"Make Preview"预览后"ok"出图。
96与光学图像叠加：选中目标图像，菜单"Project → Overlay Images"，点"Open overlay bitmap"选光学图，调整尺寸、角度与透明度对齐离子图，"Save overlayed image"保存。
预期结果
- 该方案能在不化学固定的前提下切出小而脆样品的无损切片，同时保留形态与化学组成，为脂质、代谢物和候选药物的高分辨质谱成像奠定基础；单次测量可同时获得数百种分析物的半定量空间分布。
- 零损耗对照：常规样品台上刀片无法切到最边缘，小样品必然留下无法分析的残余；明胶平台让样品被完整切穿。传统冷冻包埋剂（cryomold）包埋则依赖样品在明胶块内和明胶块本身的双重正确定位，小样品根本经不起这种调整。
- 血吸虫示范：成功对合抱体成虫成像，检出药物伊马替尼（[M+H]⁺，理论 m/z 494.2663，实测 494.2655，偏差 1.70 ppm）及其与内源脂质（如 PC O-34:2，偏差 −0.21 ppm）和胆固醇（[M+H−H₂O]⁺，偏差 −0.31 ppm）的三色叠加分布图。
- 果蝇脑示范：获得脑切片的脂质分布图像（如 PC 36:4 [M+H]⁺）。
- 优化后的基质喷涂参数可直接沿用或小幅微调；微小样品切片内部也常有高度起伏，AP-SMALDI5 的 3D 表面测量能力可有效补偿。Mirion 工作流支持靶向与非靶向两种分析路径，便于快速浏览结果。
局限性
- 转移方式的普适性：既不能用镊子也不能用移液器转移的极脆样品不适用本方案，除非另行开发并适配转移方法。
- 尺寸窗口：样品必须小到能放上明胶平台，又不能小到无法转移；两端都可能通过改造转移流程突破，但需要额外优化。
- 环境敏感：温湿度变化会影响 MSI 测量的准确度与可靠性，基质喷涂同样如此；基质溶液必须现配以减少污染。样品制备、溶液配制、测量环境与测量参数的一致性是控制这些限制的关键。
Troubleshooting
| 问题（相关步骤） | 可能原因 | 解决办法 |
|---|---|---|
| 明胶穹顶有气泡（步骤 25） | 滴加方式带入空气 | 稍多取一些明胶、在 tip 排空前停止滴加可预防；已有气泡可用移液器吸走 |
| 明胶在切片机里不冻结（步骤 26） | 过冷液体状态 | 再调低切片机温度诱导结晶，或用玻璃吸管轻触穹顶一侧提供成核点 |
| 两条血吸虫合抱分不开（步骤 34） | 合抱体连接紧密 | 用羽毛镊小心分离，可在显微镜下操作；用第二把镊子固定一侧更易分开 |
| 平台上只能放单性别虫（步骤 34） | 需要雌雄并排时 | 方案 A：只取一条，仅测单性别；方案 B：雌雄都放入水滴，吸水后先放雄虫上平台，紧挨着放雌虫，必要时两者之间先把样品台回冷，然后从步骤 39 继续 |
| 果蝇脑吸不进移液器（步骤 44） | 脑粘在玻片表面 | 转移前先轻触脑附近，tip 紧贴脑旁；可能需要显微镜辅助精确定位，注意别损伤样品 |
| 切片碎裂/拖尾/撕裂/粘在导片板上（步骤 52） | 刀片缺损、温度、速度、导片板位置 | 裂纹：加厚切片或换刀，调整速度与导片板位置；拖尾：调低切片机温度；完全撕裂：调整导片板或速度，不行就改用胶带取片；粘板：用乙醇清洗切片机、刀片与导片板 |
| 喷雾仪堵塞（步骤 67） | 析出物堵喷嘴 | 大流速（如 30 mL/min）溶剂冲洗至少 30 min，溶剂极性按堵塞物调整；喷头另用 2 mL 溶剂浸泡喷嘴至少 30 min |
| 基质晶体过大（步骤 67） | 晶体尺寸须 ≤ 步长 | 降低喷雾流速；仍不够可改用基质升华法获得更小晶体 |
| 自动对焦在部分位置识别不到表面（步骤 79） | 三维样品锐边处基质结晶不均、局部无覆盖 | 喷更厚的基质层（如基质用量增加 20%），保证锐边处完全均匀覆盖 |
联系与资源
- Lead contact：Bernhard Spengler 教授（bernhard.spengler@anorg.chemie.uni-giessen.de）
- 技术联系人：Annika Sabine Mokosch（annika.s.mokosch@anorg.chemie.uni-giessen.de）、Max A. Müller（max.a.mueller@transmit.de）
- 本研究未产生新的独特试剂；数据集可向 lead contact 申请。