新生鼠原位 DMG 模型 + 序贯切片多组学：脑胶质瘤肿瘤微环境空间图谱方案

新生鼠原位 DMG 模型 + 序贯切片多组学：脑胶质瘤肿瘤微环境空间图谱方案

原文：Collot R, Honhoff C, Ruiz-Moreno C, van Ineveld RL, Rios AC. STAR Protocols（2026），DOI: 10.1016/j.xpro.2026.104801，PMC13506531（荷兰 Princess Máxima 儿童肿瘤中心，Rios 实验室）

本文为中文编译版，供方法学习参考，引用请注明原始出处。

一句话读懂这篇 Protocol

脑干弥漫中线胶质瘤（DMG）是儿童最致命的脑肿瘤之一，但它的"土壤"——肿瘤微环境（TME）——很难在贴近真实发育背景的动物模型里做空间分辨研究。这篇方案用出生后第 3–5 天（P3–P5）的免疫健全乳鼠做脑立体定位注射，建立脑桥 DMG 同源移植瘤；取瘤脑后液氮速冻，从同一只鼠的相邻冷冻切片上分别做单核 RNA 测序（snRNA-seq，10× Chromium 3′）、10× Visium 空间转录组、以及循环免疫荧光（cIF）蛋白验证，最后用作者开源的 Python 配准管线把多轮 cIF 图像对齐——一份组织、三个维度（单细胞、空间、蛋白），把肿瘤微环境"画"在解剖坐标上。

方案亮点与创新点

• 发育时点贴合疾病：DMG 是婴幼儿肿瘤，经典成人鼠模型偏离其发育背景。本方案把注射窗口改到出生后早期（P3–P5），在免疫健全的 C57BL/6N 乳鼠脑桥原位成瘤，更贴近 DMG 的发育时间轴；总体实验成功率约 80%，荷瘤鼠中位生存 30–50 天。
• 同一肿瘤、序贯切片、三种模态：同一脑块相邻 10 μm 切片依次用于 snRNA-seq（≤1 周内使用）、Visium（≤4 周）和 cIF（≤4 周），切片间距建议 10–30 μm，组织结构和细胞构成保持一致，使转录组与蛋白组数据可直接互相对照。
• 不依赖专用设备的循环免疫荧光：普通荧光显微镜（带自动载台、四通道 405/488/555/647 nm）即可完成多轮染色—成像—洗脱，无需商用自动化染色系统（Lunaphore/MACSima）。
• 开源图像配准管线：作者发布 CycFluoCoreg-STAR（GitHub），在 Jupyter Notebook 中把多天成像轮次自动对齐并输出多通道合并图像，免去商业软件，且附带示例数据集。
• 乳鼠核分离优化：针对新鲜冷冻鼠脑冷冻切片优化了单核分离条件（Dounce 匀浆 + FANS 分选），单次 10× 上机可回收约 7,000–10,000 个核。

开始之前

机构许可

所有小鼠实验须符合当地及国际法规并经机构动物伦理委员会批准（原文：Princess Maxima Center 动物福利委员会）。饲养条件：SOPF 级、独立通风笼、45%–65% 湿度、20.5–23.5°C、12 h 明暗交替，无菌饲料与饮水自由摄取。使用时间孕 C57BL/6N 小鼠做定时交配与乳鼠注射。

前置准备

关键资源（节选）

类别	内容	来源 / 标识符
细胞系	IUE 来源鼠源 DMG 24B7 球体（C57BL/6NCrl 背景；源自 Phoenix 实验室，Hulleman 实验室馈赠）	Princess Máxima Center
实验动物	C57BL/6NCrl 小鼠，新生乳鼠（雌雄）	Charles River，Strain# 475
主要抗体（cIF）	兔抗 H3K27M（1:400，MA5-27916）、兔抗 PDGFRA（1:400，CST#3174）、羊抗 IBA1（1:300，NB100-1028）、兔抗 IGSF11（1:100，703178）、兔抗 VISTA（1:200，54979）、大鼠抗 TREM2（1:100）、小鼠抗 CD206（1:100）、小鼠抗 CD44（1:100，555476）、大鼠抗 CD31（1:200，553370）	Thermo/CST/Novus/Biotechne/BD
核心试剂盒	Chromium Single Cell 3′ v3.1（PN-1000269）；Visium Spatial Gene Expression Slide & Reagent Kit（PN-1000187）；RNeasy Mini（74104）；Bioanalyzer High Sensitivity RNA（5067-1513）	10× Genomics / QIAGEN / Agilent
主要设备	立体定位框架（Stoelting 53311）、10 μL Hamilton 微量注射器（87930）、CryoStar NX50 冷冻切片机、Leica Thunder Imager 荧光显微镜	Stoelting / Hamilton / Thermo / Leica
分析软件	Seurat 4.0、Scanpy 1.9.3、DoubletFinder、Numbat、Cell2location、SCpubr、dittoSeq、QuPath、Cell Ranger / Space Ranger、R 4.0.2 / Python 3.9	开源

完整试剂清单（含目录号）见原文 Key Resources Table。

材料与配方

4% PFA：多聚甲醛（珠粒，95%）20 g + PBS 定容 500 mL；分装 −20°C 保存 6 个月，用前解冻、勿反复冻融。

DMG 基础培养基（500 mL）：Neurobasal-A 239.5 mL + Advanced DMEM/F12 239.5 mL + MEM 非必需氨基酸（100×）5 mL + GlutaMAX（100×）5 mL + 丙酮酸钠（100 mM）5 mL（终浓度 1 mM）+ HEPES（1 M）5 mL（终浓度 0.01 M）+ Primocin 1 mL（终浓度 0.1 mg/mL）；4°C 保存不超过 3 个月。

DMG 工作培养基（50 mL）：DMG 基础培养基 49 mL + B-27 无维生素 A（50×）1 mL（1×）+ 人重组 FGF-basic 10 μL（20 ng/mL）+ 人重组 EGF 10 μL（20 ng/mL）+ 人重组 PDGF-AA 5 μL（10 ng/mL）+ 人重组 PDGF-BB 5 μL（10 ng/mL）+ 肝素 50 μL（2 μg/mL）；4°C 保存不超过 1 周。

cIF 各缓冲液（4 张玻片用量）：

• 淬灭缓冲液：甘氨酸 0.1 M（7.5 mg）+ 无核酸酶水定容 1 mL，现配现用。
• 通透缓冲液：Triton X-100 0.2%（20 μL）+ PBS 定容 10 mL，室温存放 2 周。
• 封闭缓冲液：NH₄Cl 100 mM（26.74 mg）+ 马来酰亚胺 150 mM（72.80 mg）+ 驴血清 10%（0.5 mL）+ PBS 定容 5 mL；4°C 保存、每 2–3 天现配。替代：MACSima Running Buffer + 10% 驴血清。
• 染色缓冲液：NH₄Cl 100 mM（53.49 mg）+ 驴血清 5%（0.5 mL）+ PBS 定容 10 mL；4°C 保存、每 2–3 天现配。替代：MACSima Running Buffer + 5% 驴血清。
• 洗脱缓冲液：甘氨酸 0.5 M（37.56 mg）+ 盐酸胍 3 M（287.2 mg）+ 尿素 3 M（180 mg）+ TCEP 40 mM（11.48 mg）+ 无核酸酶水定容 1 mL，现配现用。替代：Lunaphore Elution Buffer Kit（按说明书混合 Solution 1 与 2）。

Tris 基础缓冲液（10 mL，够 2 个样本）：Tris-HCl pH 7.4（1 M）100 μL（终 10 mM）+ NaCl（5 M）292 μL（终 146 mM）+ MgCl₂（1 M）210 μL（终 21 mM）+ CaCl₂（1 M）10 μL（终 1 mM）+ 无核酸酶水 9,388 μL；现配现用。

核裂解缓冲液（4.05 mL，够 2 个样本）：Tris 基础缓冲液 3.995 mL + RNasin（40 U/μL）10 μL（终 100 U/mL）+ NP-40（10%）40 μL（终 0.1%）；现配现用、4°C。

洗涤缓冲液（约 5 mL，够 2 个样本）：Tris 基础缓冲液 3.995 mL + PBS+BSA（10% BSA 储液）1 mL（终 2% BSA）+ RNasin 25 μL（终 200 U/mL）；现配现用、4°C。

分选用 10× RT 缓冲液（每样本）：RT 试剂 20 μL + TSO 3.1 μL + 还原剂 B 2 μL + 无核酸酶水补至 71.7 μL（分选前总量）；分选后加 RT Enzyme C 8.3 μL 至终体积 80 μL，立即上芯片。现配现用、4°C。

分选 DAPI 染色：DAPI 3 μM——每 500 μL 核悬液加 2.5 μL；现配现用。

分步方案

阶段一：定时交配（耗时约 10 min 设置 + 妊娠期）

注意：按每窝最多注射 6 只乳鼠规划；C57BL/6N 每窝约 5–8 只（因群体而异），建议参考品系繁殖资料并与动物房沟通预估产仔量。初产母鼠育幼表现更不稳定，优先选用成功哺育过一窝的母鼠。

阶段二：IUE 来源 DMG 细胞准备（耗时 20–30 min）

注意：多配约 30% 余量，覆盖操作损耗与 Hamilton 注射器死体积。

阶段三：注射与取材准备（耗时分别约 30 min 和 1 h）

13–15. 注射准备：按材料清单备齐所有缓冲液与手术器械（图 1：3D 打印乳鼠模具 + 立体定位框架 + 手术器械）；器械珠灭菌器灭菌或 70% 乙醇浸泡，冷却干燥后使用；工作台面、立体定位设备与耗材 70% 乙醇消毒。

注意：全程保持无菌操作，降低感染风险。

16–20. 取材与速冻准备：备齐缓冲液与解剖材料；冰上预冷 PBS（心脏灌流用 + 取出脑的暂存）；搭好速冻台（冷冻包埋模具、标签、OCT、镊子、容器、异戊烷、干冰，图 2）；OCT 于 4°C 预冷 ≥1 h；异戊烷在干冰上冷却约 5 min，至半冻泥浆状；另备一盒干冰暂存包埋好的样本，随后转入 −80°C。

注意：异戊烷充分冷却是防止冰晶的关键；也可用液氮代替干冰预冷异戊烷。

阶段四：新生乳鼠立体定位注射（每窝约 30 min）

1. 乳鼠筛选与准备

• a. 清点整窝数量，对照生长曲线评估健康与体型。
• b. 按品系指南与母鼠行为选鼠：C57BL/6 每窝最多 6 只。
• c. 不注射的乳鼠用吸入麻醉过量 + 断头处死。
• d. 精密天平逐只称重并记录，用于丁丙诺啡给药（0.05 mg/kg）。

注意：尽量雌雄各半以减少偏倚。

2. 全身麻醉与镇痛

• a. 乳鼠放入预 warming 加热垫上的诱导舱。
• b. 氧气中给 4% 异氟烷 4 min。
• c. 轻捏脚趾无反应确认麻醉深度。
• d. 按记录体重皮下注射丁丙诺啡（0.05 mg/kg）。

3. 上框架与局部手术准备（图 1、图 4）

• a. 3D 打印模具装入框架并接异氟烷维持麻醉。
• b. 乳鼠移入模具，确保头身对齐。

注意：模具不加热，术中低体温风险高——尽量缩短手术时间，必要时用手遮挡保温。

• c. 头皮涂利多卡因乳膏（20 mg/g），等 1–2 min 起效。
• d. 头皮正中小切口暴露颅骨，辨认人字缝（lambda）与矢状缝。
• e. 颅骨表面滴 50 μL 利多卡因溶液（10 mg/mL）加强局部麻醉。

4. 脑桥后部立体定位注射

• a. 异氟烷降至 3% 维持稳定麻醉。
• b. 将 2 μL PBS（含 300,000 个 DMG 细胞）装入 10 μL Hamilton 微量注射器（2-pt 针头），排尽气泡。

注意：按死体积计算，不重装最多可连打 4 只；每次装载前确认针头未堵。

• c. 针尖定位于 lambda，再移动到脑桥后部坐标：lambda 后 3 mm、中线旁 0 mm。

注意：该坐标沿用已发表方案，多名操作者复现一致。

• d. 缓慢下降针头至接触颅骨表面。
• e. 针尖轻压刺穿颅骨直至阻力消失。

注意：新生鼠颅骨曲面且有个体差异——头位必须在模具中稳固、针与颅骨垂直，防止打滑或偏位穿透。

• f. 穿颅后微微回提针头，深度归零，从颅骨表面重新计量。
• g. 降到目标深度 3.5 mm，以 2 μL/min 注射 2 μL 细胞悬液。
• h. 异氟烷降至 1%，注射完成后留针 30 s，缓慢退针。每次注射间轻弹注射器重悬细胞。

注意：若细胞带 GFP 构件，可用 GFP 信号验证注射定位（图 4C）；也可用组织学或抗体染色确认移植成功。

5. 缝合与标记

• a. 组织胶闭合皮肤切口，确保完全封合。
• b. 必要时用微量纹身系统标记实验分组。

6. 术后恢复监测

• a. 乳鼠转入放在预热加热垫上的培养皿（垫少量原笼垫料，保留熟悉气味）。
• b. 监测呼吸与自主活动直至完全苏醒。
• c. 呼吸延迟时给予轻柔触觉刺激。
• d. 所有注射完成的乳鼠集中放置，直到整窝处理完毕。

7. 回笼与母鼠行为观察

• a. 乳鼠完全活跃、呼吸规律后再回笼。
• b. 回笼 2 h 后观察母鼠行为：躁动、频繁叼崽、不哺乳等弃养迹象。
• c. 若发生弃养，转交寄养母鼠，或吸入麻醉过量 + 断头安乐死。

阶段五：术后监测与肿瘤进展评估（注射日起 4–6 周）

注意：尽量少惊扰笼子与整窝幼崽——频繁抓取和应激会提高母鼠弃养风险。

注意：若细胞含荧光素酶构件可加做生物发光成像（BLI），或有 MRI 时用 MRI 跟踪瘤负荷；两者均为可选——定期福利评估即可确定人道终点。

• 按总体活动、外观、行为、体重、体态、神经体征、手术部位外观逐项评分。
• 逐鼠记录，追踪随时间的变化与早期成瘤迹象。

注意：固定时间点评估，减少测量间变异。

注意：青春期前小鼠的体重应对照同龄生长曲线和同窝对照判断，才能准确识别消瘦。

阶段六：深麻醉与心脏灌流取脑（每只 20–30 min）

• a. 腹腔注射氯胺酮（75 mg/kg）+ 美托咪定（1 mg/kg）。
• b. 等 5 min，脚趾夹捏无反射后继续。

• a. 小鼠四肢展开固定于解剖板。
• b. 腹部喷少量乙醇固定毛发、防污染。
• c. 胸腹正中切口、去掉皮肤，暴露胸腔。
• d. 剪开并翻起膈肌与肋骨，充分暴露心脏与大血管。

注意：小鼠可能有反射性喘息，但麻醉深度足以避免痛觉。

• a. 找到心尖，镊子固定心脏。
• b. 注射器抽 20 mL PBS，针头插入左心室。
• c. 缓慢推注 PBS 直至心脏膨起。

• d. 肝脏剪小口建立流出道。
• e. 持续灌流至肝脏变白，提示清血有效。

阶段七：速冻、OCT 包埋与冷冻切片（共 3 天）

• a. 从冰冷 PBS 中取出完整脑。
• b. Kimtech 纸吸干，放入冷冻包埋模具。

注意：记下脑在模具中的方向，方便后续切片。

• c. OCT 覆盖全脑，不引入气泡。
• d. 模具移入异戊烷浴至完全冻结。
• e. −80°C 过夜或长期保存。

• a. OCT 组织块从 −80°C 取出，入切片机冷室（−20°C）平衡 ≥30 min。
• b. 离心管与毛刷在切片机内预冷。
• c. 组织块装上切片机载台，腹侧朝下，水平切片。
• d. 切 10–12 片 10 μm 厚切片，必要时修去组织周围多余 OCT。

• e. 毛刷轻柔转移切片入预冷微量离心管。

• f. 立即放干冰。−80°C 保存或直接提 RNA，全程避免冻融。
• g. 剩余组织块切面覆一层薄 OCT，−80°C 保存待用。
• h. 按 QIAGEN RNeasy Mini Kit 动物组织流程提取 RNA。
• i. Bioanalyzer 测 RIN 值，RIN >7 才继续。

注意：新鲜冷冻组织 RIN 应在 7–10 之间。

注意：收集 snRNA-seq 切片前，先用普通荧光显微镜确认切片含足够肿瘤细胞（查 GFP 信号）。

• a. 重复步骤 17a–e。
• b. 立即放干冰。
• c. −80°C 保存，1 周内使用。

• a. Visium 空间芯片在切片机内（闭合玻片盒）预冷 ≥20 min。

• b. 紧贴最后一张 snRNA-seq 切片处切 10 μm。

• c. 切片轻贴到预平衡的 Visium 芯片捕获区（芯片活性面轻触组织）。

注意：组织太大超出捕获区时，用干净刀片在组织块上划痕修块。贴片细节见 Visium 组织制备指南。

• d. 手指在捕获区背面轻压数秒确保贴附，移入冷台快速冻结。
• e. 芯片放回玻片盒，封口膜密封。
• f. −80°C 保存，4 周内使用。

• a. 普通显微镜玻片在切片机内预冷 10 min（闭合玻片盒）。
• b. 紧贴最后一张 Visium 切片处切 10 μm。

注意：虽然下游分析不强制，但把 cIF 切片收在 Visium 切片 10–30 μm 范围内，可保持两模态间组织结构与细胞构成相似，便于转录组与蛋白组对照。

• c. 切片放玻片中央，指背轻压数秒确保贴附。
• d. 移入冷台快速冻结。
• e. 放回玻片盒，封口膜密封。
• f. −80°C 保存，4 周内使用。

阶段八：单核 RNA 测序（核分离 + 分选 3–4 h；建库 1 天）

注意：10× Chromium 双联体发生率约为每 2,000 个核 1%（捕获 15,000 核时约 6%–7%）。脑 snRNA-seq 计算检出双联体通常 3%–6%；QC 过滤后 <10% 一般可接受，超阈值样本应标记并考虑重新分离或剔除。

• a. 冷冻切片从 −80°C 取出，放在冰镇金属块上。
• b. 预冷离心管中加 500 μL 冰冷核裂解缓冲液，轻柔吹打解离切片。
• c. 悬液转入 2 mL Dounce 匀浆器。
• d. 冰上匀浆：松杵 5 次 + 紧杵 10 次。

注意：无 Dounce 匀浆器时，可用优化的裂解缓冲液 + 短时孵育替代机械匀浆（文献已描述）；得率与质量因组织而异，须先行验证。

• e. 匀浆转入 2 mL DNA LoBind 管；再用 1 mL 冰冷裂解缓冲液涮洗匀浆器，合并。
• f. 核悬液冰上孵育 5 min，期间轻混 1–2 次。

• a. 匀浆经 70 μm 吸头式滤器过滤入新 1.5 mL DNA LoBind 管。
• b. 4°C、500 × g 离心 5 min。小心吸上清，留约 50 μL 保护沉淀。
• c. 0.5 mL 洗涤缓冲液轻柔重悬，吹打 10 次至无明显团块。
• d. 显微镜下检查核完整性与团块。
• e. 再加 1.0 mL 洗涤缓冲液。
• f. 4°C、500 × g 再次离心 5 min。小心吸上清勿扰沉淀；沉淀松散时留约 50 μL 残液。
• g. 300–500 μL 洗涤缓冲液重悬，冰上待用。
• h. 光镜或细胞计数仪复核核完整性与质量。

• a. 分选前立即经 40 μm 吸头滤器过滤。
• b. 每 500 μL 核悬液加 2.5 μL DAPI。
• c. 染色后冰上保存，直接进分选。

• a. 提前备好冰冷 10× RT 缓冲液（暂不加 RT Enzyme C）。
• b. 按 DNA 含量设门圈定单个核，排除碎片与聚集体（图 5：FSC-A/BSC-A 去碎片 → DAPI 面积/高度圈单倍体 → DAPI-A/SSC-A 去双联体与聚集体 → DAPI 直方图确认单一均一群）。
• c. 核直接分选入冰冷 10× RT 缓冲液。
• d. 每管收集约 15,000 个核，供后续 Chromium 3′ 处理。

• a. 分选完成后立即加 8.3 μL RT Enzyme C，轻柔混匀。
• b. 按 10× 用户指南上芯片。
• c. 依厂商流程完成 GEM 生成、逆转录、cDNA 扩增与文库构建。
• d. 按 Chromium 3′ 推荐上机测序。单核文库最低 25,000 reads/核；脑肿瘤组织建议 25,000–50,000 reads/核以保证基因检出深度。下游用 Cell Ranger 配 pre-mRNA 参考（含内含子 reads）——snRNA-seq 必需，可捕获未剪接的核转录本。

阶段九：10× Visium 空间转录组（2 天）

注意：抗体及浓度须先在 Visium 芯片上验证兼容甲醇固定。

注意：10 μm 成年鼠脑切片实验确定最优通透化时间为 16 min；通透时间须按组织类型与切片厚度优化。标准 Visium 在新鲜冷冻组织上每斑点应检出 1,000–5,000 个基因。

阶段十：循环免疫荧光与数据采集（3–14 天，取决于成像轮数）

循环流程（28–32）按需重复，直至覆盖全部标志物。

注意：开跑前，每个抗体/标志物组合须在目标组织上用相同染色条件验证；弱标志物配强二抗，免疫标志物等脆弱表位安排在早期轮次成像；同一物种的两支抗体不可放同一轮。

注意：封片剂不要用会凝固的；避免气泡，封片层要均匀且薄。

注意：反复染色—洗脱会在 >5 轮后降低抗体性能；敏感或弱表达表位的抗体放前几轮，panel 优化阶段实测抗体跨轮性能。

• a. 未固定冷冻切片从 −80°C 取出，PCR 仪 37°C 解冻 3 min，立即进入下一步。
• b. PAP 笔绕组织画疏水圈。
• c. 组织上加 4% PFA 后固定，室温 10 min。
• d. 去掉 PFA，玻片入室温 PBS 浸洗 5 min，换新 PBS 重复。
• e. 0.1 M 甘氨酸淬灭，室温 20 min。
• f. 室温 PBS 洗 2 × 5 min。
• g. 加 0.2% Triton X-100 通透，室温 10 min。

注意：通透条件按组织类型与厚度优化，建议测试 5–15 min；过度通透会破坏染色。

• h. 室温 PBS 洗 2 × 5 min。
• i. PBS 中过夜存放，或直接进行下一步。

• a. 玻片移入湿盒，加封闭缓冲液完全覆盖组织，室温轻摇 ≥1 h。
• b. 一抗按预先确定的浓度在染色缓冲液中稀释。

注意：多色组合前须逐支验证一抗——优化浓度、确认预期着色模式、评估背景；只有特异且可重复的抗体才能进 panel。

• c. 吸掉封闭液（勿触组织），加一抗混合液，室温轻摇孵育 2 h。
• d. 出湿盒，室温 PBS 洗 3 × 5 min。

• a. 二抗与核染料按预定浓度稀释于染色缓冲液。
• b. 二抗混合液最大转速（>10,000 rpm）离心 10 min。
• c. 弃底部 50 μL（含可能的抗体聚集体），用余下液体。
• d. 玻片入湿盒，加二抗混合液，室温避光轻摇孵育 2 h。
• e. 出湿盒，室温 PBS 洗 3 × 5 min。
• f. Kimtech 纸吸干组织周围残液。
• g. 每张切片加 20 μL 封片剂，缓慢盖上盖玻片。

• a. 玻片放入荧光显微镜。

注意：显微镜需带自动载台、拼图扫描、四通道（405/488/555/647 nm）能力；空气物镜分辨率须满足下游分析，且任何步骤不得触碰玻片。

• b. 圈定略大于组织的 ROI，保存于显微镜设置中供后续几天复用。
• c. 定义焦面图。
• d. 按染色要求调曝光与光源亮度，整片成像。不用 Z-stack。
• e. 拆片前逐图检查，保存合并后的拼图扫描。
• f. 玻片以 30° 角浸入 PBS，盖玻片朝下。
• g. 盖玻片靠重力滑落。

注意：几分钟后仍未滑落时不要硬掀——用镊子轻推盖玻片滑离组织，避免损伤。

• h. 室温 PBS 洗 2 × 5 min。
• i. 玻片 4°C 过夜存于 PBS，或直接进入下一轮染色。两轮间隔不超过 48 h。

• a. 现配洗脱缓冲液。
• b. 玻片入湿盒，加洗脱缓冲液完全覆盖组织，室温轻摇 3 min。
• c. 去掉洗脱缓冲液，室温 PBS 洗 2 × 5 min。
• d. 从步骤 29 重复到 32，直至覆盖全部计划标志物。

阶段十一：图像配准（设置约 30 min；运行时间取决于数据量与算力）

Python + Jupyter Notebook 环境运行开源管线 CycFluoCoreg-STAR，把多天成像对齐、输出合并多通道图像。

注意：算力需求取决于图像尺寸、位深、轮数与硬件。演示数据集用多核 CPU、SSD、32 GB 内存的笔记本即可；完整多天 cIF 数据集更大——作者用 32 核 CPU、256 GB 内存工作站处理。

- 方式 A（推荐，Git）：

```

git clone https://github.com/Dream3DLab/CycFluoCoreg-STAR.git

cd CycFluoCoreg-STAR

```

- 方式 B（ZIP）：GitHub 仓库页 → 绿色 "Code" 按钮 → "Download ZIP" → 解压 → 终端进入解压目录。

```

conda env create -f coregenvironment.yml

```

```

conda activate coreg

```

- a. 终端启动：jupyter lab（浏览器中可能需要认证登录）。

- b. 打开 CycFluoCoreg-STAR.ipynb。

- c. 按文件位置修改笔记本顶部 "Input paths"。

- d. 可选：调整 "Analysis parameters"。

- e. Ctrl + Enter 逐步运行。

- f. 完成后检查 QC 报告文件（图 6）。

• a. 用 QuPath 等支持多路复用图像的软件打开配准后文件。
• b. 按标志物重命名通道。
• c. 同时点亮所有 DAPI 通道，目检各轮对齐情况。

预期结果

按本方案可获得 DMG 肿瘤微环境主要细胞类型的完整空间图谱，覆盖关键 RNA 与蛋白标志物。

• 动物模型：新生期 DMG 异种同源移植模型在免疫健全、脑发育相关背景下可重复成瘤。
• 组织质量：取脑时心脏灌流 + 快速冻存保证 snRNA-seq 与 Visium 适用的高质量组织，RIN 通常 >7。
• snRNA-seq：单张鼠脑切片的核分离（步骤 21）足够每次 10× Chromium 捕获约 7,000–10,000 个核；高质量数据每核检出基因 ≥200、UMI ≥500，过滤后双联体率 <10%；建议测序深度 25,000–50,000 reads/核。
• Visium：每个捕获区最大 6.5 × 6.5 mm，约 3,000–5,000 个斑点落在组织上；55 μm 斑点直径对应每点约 1–10 个细胞；建议 ≥25,000 reads/斑点。转录组数据可反过来指导 cIF 抗体 panel 设计，实现正交验证。
• 设备友好：染色、成像与配准全程用常规实验室设备即可完成，无需专用基础设施。

定量与统计分析

• 上游比对与定量：Cell Ranger（snRNA-seq）与 Space Ranger（Visium）完成比对、条码拆分与计数矩阵；Loupe Browser 做交互式探索与可视化。
• snRNA-seq 下游：Seurat 或 Scanpy（SeuratWrappers 互通）做预处理、聚类与细胞注释。作者数据集的 QC 过滤标准：检出基因 <200、线粒体 reads >5%、或被 DoubletFinder 判为双联体的核剔除。用 Numbat 做拷贝数变异推断，区分恶性与非恶性细胞——TME 研究中区分肿瘤与免疫/基质细胞群的关键步骤。
• 空间转录组：Cell2location 把单核定义的细胞状态映射到 Visium 斑点，将转录组与空间坐标关联；SCpubr、dittoSeq 生成出版级图表。
• cIF 分析：QuPath 免费完成细胞识别、机器学习细胞分类与特征提取（详细多路成像分析指南见官方文档）；商业方案可用 MACS iQ View（Miltenyi）。提取的细胞特征导出后在 R Studio 分析。
• 分析路径最终取决于科学问题、组织与病理状态；上述组合是作者针对 DMG TME 的有效方案，其他工具同样可选。

局限性

• 立体定位精度：新生鼠脑体积小，脑桥注射位点存在变异；注射体积须 <2 μL，细胞反流风险更高，影响可重复性；操作精度依赖细致的定位与手法，初学阶段操作者间差异明显。
• 空间分辨率：标准 Visium（55 μm 斑点）每点捕获多个细胞的转录本，必须做计算反卷积（通常依赖配套 snRNA-seq）。更高分辨率的 10× Visium HD、10× Xenium、Bruker CosMx 可克服此限制，但需专用设备且不都提供全转录组。
• 新鲜冷冻依赖：本方案为兼容 snRNA-seq、Visium 与 cIF 而针对新鲜冷冻组织优化；固定组织（灌注固定后）的 cIF 信号通常更好。10× Flex 与 Visium HD 等新技术可用于固定冷冻与 FFPE 样本，可作为替代。
• 手动 cIF：手动流程需要反复拆盖玻片，与 Lunaphore/MACSima 等自动化平台相比，组织损伤和批间变异风险更高。

Troubleshooting

问题 1：Hamilton 注射器装载或注射时针头堵塞（对应步骤 4）

• 细胞活力低会增加碎片导致堵塞：用活力 >80% 的悬液、保持冰上、装载前充分重悬。
• 细胞浓度过高易堵：稀释悬液并相应调整注射体积（不超过 2 μL）；重新装载前彻底清洗注射器。

问题 2：术后乳鼠无法恢复（对应步骤 6）

• 低体温是主要风险：缩短操作时间、术前术后用加热垫、避免乳鼠身上残留过多液体。
• 监测呼吸并相应调整麻醉。
• 确保注射坐标准确——脑桥损伤会影响呼吸。

问题 3：RNA 质量差（RIN 值低，对应步骤 17）

• 避免取坏死严重或 OCT 过多的切片。
• 压缩安乐死到灌流、速冻的时间。
• 全程无 RNase：清洁工具与台面、使用无菌耗材。

问题 4：冷冻切片碎裂或褶皱（对应步骤 18–20）

• 组织块在 −20°C 平衡 30–60 min 再切。
• 优化切片温度（脑组织从约 −12°C 起试）。
• 先用练习块练手、在普通玻片上优化贴片，再上 Visium 芯片。

问题 5：核得率低——沉淀丢失、过滤堵塞或分选体积不足（对应步骤 22–24）

• 固定角转子离心时核沉淀可能贴在管壁侧面而非管底。离心后记录离心管朝向，从对侧吸上清，轻柔冲洗预期沉淀区。
• 过滤遇阻力提示团块或碎片：不要硬推，轻柔重悬后重新过滤；仍成团则先重复洗涤。
• 分选后终体积取决于仪器设置与喷嘴口径：实测收集体积，必要时用冰冷 RT 缓冲液（不加酶 C）补足 Chromium 上机要求；先做预实验标定本机分选体积。

问题 6：循环免疫荧光中组织损伤或脱落（对应步骤 28–32）

• 延长 37°C 干燥时间（2–3 min）增强贴附。
• 使用高粘附玻片。
• 染色与洗涤动作轻柔，枪头避免直接接触组织。
• 处理前弃掉褶皱或已损伤的切片。

资源可用性

• 主要联系人：Anne C. Rios（a.c.rios@prinsesmaximacentrum.nl）
• 技术联系人：Raphaël Collot（r.v.u.collot@prinsesmaximacentrum.nl）
• 材料：本研究未产生新的独特试剂。
• 数据与代码：原始研究测序数据见 Zenodo（doi.org/10.5281/zenodo.21513336）；图像配准代码 CycFluoCoreg-STAR 及示例数据集见 GitHub（github.com/Dream3DLab/CycFluoCoreg-STAR）。