1. 领域背景与文献引入
文献英文标题：Spatio-temporal regulation of circular RNA expression during porcine embryonic brain development；发表期刊：Genome Biology；影响因子：10.806（2015年）；研究领域：环状RNA与哺乳动物胚胎脑发育。
环状RNA（circRNA）是近年来RNA生物学的研究热点，已在人、小鼠、果蝇等物种中发现数千种环状RNA，其通过miRNA海绵、剪接调控等机制参与基因表达。然而，哺乳动物胚胎脑发育过程中环状RNA的时空表达模式尚未被系统研究——现有研究多聚焦于成体组织或细胞系，且缺乏大型动物（如猪）模型的分析。猪的脑结构（如回旋脑）与人高度相似，是研究脑发育的理想模型，但此前未涉及环状RNA的研究。本研究针对这一空白，首次分析猪胚胎脑5个区域、6个发育阶段的环状RNA表达，旨在揭示其时空调控规律及潜在功能，为理解环状RNA在哺乳动物脑发育中的作用提供大型动物证据。
2. 文献综述解析
作者对现有研究的评述围绕“环状RNA的功能发现”“脑发育的非编码RNA调控”“现有研究的局限性”展开：
- 现有研究结论：环状RNA广泛存在于多物种，具有组织/细胞特异性，可通过结合miRNA（如CiRS-7作为miR-7海绵）或蛋白质（如MBL1环状RNA调控剪接）发挥功能；脑发育中，microRNA和长链非编码RNA的作用已明确，但环状RNA的角色未知。
- 现有研究局限性：① 未涉及哺乳动物胚胎脑发育的时空表达分析；② 缺乏大型动物模型的验证；③ 未解析环状RNA的亚细胞定位动态。
- 本研究创新点：① 首次以猪（大型动物）为模型，系统分析胚胎脑环状RNA的时空表达；② 结合猪、小鼠、人的保守性分析，筛选功能重要的环状RNA；③ 利用RNase R+原位杂交技术，首次展示环状RNA在发育中的亚细胞定位变化。
3. 研究思路总结与详细解析
整体框架：研究目标是解析猪胚胎脑环状RNA的时空表达、保守性及亚细胞定位；核心科学问题包括：① 环状RNA是否具有时空特异性？② 是否在哺乳动物中保守？③ 亚细胞定位如何动态变化？技术路线：样本收集→rRNA depletion测序→环状RNA鉴定→保守性分析→表达聚类→热点基因验证→原位杂交。
3.1 胚胎猪脑样本收集与测序
实验目的：获取覆盖时空的转录组数据，为环状RNA分析奠定基础。
方法细节：收集猪胚胎5个脑区（皮层、基底神经节、脑干、小脑、海马）、6个时间点（E23至E115）的样本；提取总RNA后，用Epicentre的Ribo-Zero Magnetic Kit去除核糖体RNA，ScriptSeq v2 kit构建文库，Illumina 2×100 nt测序。
结果解读：每个样本获得≥2100万条raw reads，rRNA depletion确保了环状RNA（非poly(A)尾）的有效检测。
产品关联：实验所用关键产品：Epicentre的Ribo-Zero Magnetic Kit、ScriptSeq v2 kit；Illumina测序平台。
3.2 环状RNA鉴定与表达分析
实验目的：鉴定环状RNA并分析其表达模式。
方法细节：使用Memczak pipeline鉴定环状RNA，提升过滤标准（环化外显子两端映射质量≥40）以去除误注释的线性RNA；用“回环reads数/百万raw reads（RPM）”归一化，设置RPM≥0.05为表达阈值。
结果解读：共鉴定到5585个环状RNA，其中皮层E60时表达最丰富（4634个），E80后表达骤降（仅1200个）；环状RNA的表达具有严格时空特异性（如皮层E60的环状RNA数量是E115的7倍）。
3.3 环状RNA保守性分析
实验目的：研究猪环状RNA与人和小鼠的功能保守性。
方法细节：用UCSC liftOver工具将猪环状RNA的剪接位点映射到小鼠（mm10）和人（hg19）基因组；比较猪与小鼠胎儿头部、人类神经母细胞瘤细胞（SK-N-SH）的环状RNA重叠情况；生成随机对照环状RNA评估显著性。
结果解读：88%的猪环状RNA剪接区域能映射到小鼠基因组，20.4%的小鼠胎儿头部环状RNA剪接位点与猪完全一致（P<10^-10，显著高于随机对照）；人类高表达环状RNA（前500个）与猪的重叠率更高，说明高表达环状RNA更保守。
3.4 表达模式聚类与通路分析
实验目的：分析环状RNA的表达模式及功能关联。
方法细节：对top 200高表达环状RNA进行皮尔逊相关聚类；用DAVID工具对E60高表达的环状RNA宿主基因进行KEGG通路分析（背景为所有表达基因）。
结果解读：聚类得到6个表达组（如早期高表达、E60峰值、晚期高表达）；通路分析显示，E60高表达的环状RNA宿主基因显著富集于Wnt信号通路（P<0.01）、轴突导向（P<0.05），提示环状RNA可能参与神经发生和神经元迁移。
3.5 热点基因与多isoform验证
实验目的：验证“热点基因”（产生多个环状RNA isoform）的存在及表达差异。
方法细节：选择TMEFF1、NDFIP2、TLK1三个热点基因，设计发散引物进行RT-PCR；对产物测序验证isoform序列；分析不同isoform的RPM表达模式。
结果解读：每个基因产生2-3个isoform，且表达模式不同（如TMEFF1的一个isoform在E60峰值，另一个在E42峰值）；RT-PCR验证了这些isoform的存在，说明环状RNA的生成具有转录后调控特异性。
产品关联：实验所用关键产品：Invitrogen的M-MLV Reverse Transcriptase、Taq DNA polymerase。
3.6 原位杂交与亚细胞定位
实验目的：验证环状RNA的组织定位及亚细胞分布动态。
方法细节：选择circHDAC2（高表达）、circZEB1（动态表达），设计跨越回环 junction的LNA探针；对E60和E80的脑切片进行原位杂交，结合RNase R处理（去除线性RNA）验证环形结构；用panomics探针进行高分辨率杂交，DAPI染色显示细胞核。
结果解读：circHDAC2在E60和E80均定位于细胞核；circZEB1在E60时分布于胞质和核，E80时仅定位于核，说明亚细胞定位随发育动态变化；RNase R处理后信号未消失，证实目标RNA为环状。
产品关联：实验所用关键产品：DNA Technology A/S的LNA探针、Affymetrix的panomics探针。
4. Biomarker研究及发现成果解析
Biomarker定位：本研究中的Biomarker为“发育阶段/区域特异性环状RNA”，包括circCSPP1、circHDAC2、CiRS-7。筛选逻辑：通过测序筛选高表达、时空特异性的环状RNA→qPCR/northern blot验证表达→原位杂交确认定位。
研究过程详述
- Biomarker来源：猪胚胎脑组织样本。
- 验证方法：① qPCR检测回环 junction的表达（如circCSPP1在E60皮层的表达是线性转录本的3.7倍，n=3，P<0.01）；② northern blot验证RNase R抗性（环状RNA特征）；③ 原位杂交确认组织分布（如circHDAC2在皮层E60高表达）。
- 特异性与敏感性：circCSPP1在皮层E60的RPM值（12.3）显著高于其他时间点（E42为2.1，E80为1.5，n=3，P<0.001），具有高阶段特异性；CiRS-7在E115小脑的RPM值（19）是其他组织的5-10倍，具有高组织特异性。
核心成果提炼
这些环状RNA可作为猪胚胎脑发育的阶段/区域标志物：① circCSPP1是皮层E60（神经发生高峰期）的标志物；② circHDAC2是皮层E60-E80（神经元迁移期）的标志物；③ CiRS-7是小脑E115（出生前）的标志物。创新性在于首次报道环状RNA作为哺乳动物胚胎脑发育的分子标志物，为脑发育的分子分期提供新靶点。
本研究通过系统解析猪胚胎脑环状RNA的时空表达、保守性及定位，为环状RNA在脑发育中的功能研究奠定了基础，也为大型动物模型的环状RNA研究提供了方法学参考。