1. 领域背景与文献引入
文献英文标题：Lung cancer cell-intrinsic IL-15 promotes cell migration and sensitizes murine lung tumors to anti-PD-L1 therapy；发表期刊：Biomarker Research；影响因子：未公开；研究领域：肺癌免疫治疗与肿瘤细胞内源性细胞因子功能。
非小细胞肺癌（NSCLC）是肺癌的主要亚型，免疫检查点 blockade（ICB）疗法（如抗PD-1/PD-L1）已成为其标准治疗，但仅约20%~30%患者能长期获益，核心瓶颈是肿瘤微环境的免疫抑制及T细胞浸润不足。 interleukin-15（IL-15）作为重要的免疫调节细胞因子，既往研究聚焦于其对NK细胞、CD8⁺T细胞的激活作用——通过促进免疫细胞增殖、细胞毒性及记忆形成，增强抗肿瘤免疫。然而，肿瘤细胞自身表达的内源性IL-15（cell-intrinsic IL-15）的功能尚未明确：少量研究提示部分肿瘤（如肾癌）表达IL-15，但未区分内源性与外源性IL-15对肿瘤细胞自身行为（如迁移、侵袭）的影响，也未探讨其与免疫治疗敏感性的关联。
本研究针对上述空白，旨在解析肺癌细胞内源性IL-15的双重作用：一方面通过调控细胞骨架影响迁移与转移，另一方面通过重塑肿瘤微环境增强ICB疗效，为肺癌免疫治疗的生物标志物筛选及联合策略提供新依据。
2. 文献综述解析
作者通过三类现有研究的梳理，明确领域待解决问题：
1. IL-15的免疫激活作用：大量研究证实IL-15可增强NK/CD8⁺T细胞的抗肿瘤功能，但多基于外源性IL-15或免疫细胞来源的IL-15，未关注肿瘤细胞自身分泌的IL-15；
2. 肿瘤细胞表达IL-15的早期探索：少数研究发现肾癌、黑色素瘤细胞表达IL-15，但仅报道其与上皮间质转化（EMT）的关联，未深入解析内源性IL-15对肿瘤细胞迁移、侵袭的直接调控机制；
3. 内源性与外源性IL-15的功能差异：现有研究未区分两者对肿瘤细胞的不同作用——外源性IL-15可能通过肿瘤细胞表面受体发挥作用，而内源性IL-15可能通过细胞内信号通路调控功能，但具体机制未知。
现有研究的核心局限在于：未系统探讨肿瘤细胞内源性IL-15对自身生物学行为的影响，也未揭示其与免疫治疗响应的关系。本研究的创新点在于：①首次阐明肺癌细胞内源性IL-15的“双重角色”——促进肿瘤迁移但增强免疫治疗敏感性；②区分内源性与外源性IL-15的不同作用机制（内源性通过AKT-mTORC1通路，外源性通过RhoA-MLC2轴）；③提出肿瘤细胞内源性IL-15可作为预测ICB疗效的生物标志物。
3. 研究思路总结与详细解析
本研究采用“细胞功能-体内验证-机制解析-临床关联”的闭环思路，通过 loss-of-function（沉默IL-15）与 gain-of-function（过表达IL-15）策略，结合细胞实验、动物模型及临床样本分析，系统解析内源性IL-15的功能与机制。
3.1 肿瘤细胞内源性IL-15的表达验证
实验目的：确认肺癌细胞及组织中内源性IL-15的表达水平。
方法细节：①临床样本：收集6例肺腺癌患者肿瘤组织及配对正常肺组织，通过免疫组化（IHC）检测IL-15表达；②细胞系：选取A549、PC9、H1975等肺腺癌细胞系，通过qPCR、Western blot检测IL-15 mRNA及蛋白水平。
结果解读：①临床样本中，肿瘤组织IL-15的平均积分光密度（IOD）显著高于正常组织（p<0.01）；②细胞系均表达IL-15，其中A549、PC9细胞表达水平较高（文献未明确具体数值，基于图表趋势推测）。
产品关联：实验所用关键试剂包括免疫组化试剂盒（GeneTech，GK600705）、qPCR试剂盒（Vazyme，SYBR Green Master Mix），细胞系购自Cobioer Biosciences。
3.2 内源性IL-15对肿瘤细胞迁移、侵袭的体外调控
实验目的：明确内源性IL-15对肺癌细胞迁移、侵袭能力的影响。
方法细节：①构建沉默IL-15的细胞系（siRNA-IL15转染A549、PC9细胞）及过表达IL-15的细胞系（Lv-hIL-15慢病毒感染）；②通过Transwell实验检测迁移（无Matrigel）、侵袭（含Matrigel）能力；③通过活细胞成像系统（Sartorius）记录细胞运动轨迹，分析 motility（速度、距离）。
结果解读：①沉默IL-15后，A549、PC9细胞的迁移数（siRNA-IL15组 vs siRNA-Ctrl组）减少约40%~60%（p<0.05~p<0.001），侵袭数减少约50%~70%（p<0.01~p<0.0001）；②过表达IL-15后，迁移数增加约2~3倍（p<0.001~p<0.0001），侵袭数增加约1.5~2倍（p<0.01~p<0.0001）；③活细胞成像显示，沉默IL-15后细胞运动速度降低约30%（p<0.0001），过表达后速度增加约40%（p<0.0001）。
产品关联：转染试剂使用Lipofectamine 3000（Invitrogen），Transwell小室购自Corning，活细胞成像系统为Sartorius IncuCyte。
3.3 内源性IL-15对肿瘤转移的体内验证
实验目的：验证内源性IL-15对肺癌体内转移的调控作用。
方法细节：①免疫缺陷小鼠模型：将沉默IL-15的A549细胞（shIL-15）或过表达IL-15的A549细胞（Lv-hIL-15）尾静脉注射入NCG小鼠（n=3/组），7天后取肺组织行HE染色，统计转移灶面积；②免疫competent小鼠模型：将过表达IL-15的Lewis肺癌（LLC）细胞（Lv-mIL-15）尾静脉注射入C57BL/6小鼠（n=4/组），3、5、7天后检测肺转移。
结果解读：①NCG小鼠中，shIL-15组肺转移灶面积较shCtrl组减少约70%（p<0.0001），Lv-hIL-15组较Lv-hCtrl组增加约2倍（p<0.0001）；②C57BL/6小鼠中，Lv-mIL-15组肺转移灶面积在第5天较Lv-mCtrl组增加约1.8倍（p<0.0001）。
产品关联：小鼠购自GemPharmatech，HE染色试剂盒购自Servicebio，图像分析使用ImageJ软件。
3.4 内源性IL-15调控迁移的机制：AKT-mTORC1-Cdc42轴
实验目的：解析内源性IL-15促进迁移的分子通路。
方法细节：①Western blot检测AKT-mTORC1通路关键蛋白（p-AKT、p-p70S6K、p-S6）的磷酸化水平；②通过GTPase pulldown实验检测Cdc42活性；③phalloidin染色结合共聚焦显微镜观察细胞丝状伪足（filopodia）形成。
结果解读：①沉默IL-15后，p-AKT、p-p70S6K、p-S6水平降低约50%~70%（p<0.01~p<0.0001）；过表达IL-15后，上述蛋白水平增加约2~3倍（p<0.001~p<0.0001）；②过表达IL-15的细胞中，GTP结合的活性Cdc42增加约2.5倍（p<0.0001）；③phalloidin染色显示，过表达IL-15的细胞丝状伪足数量增加约1.8倍（p<0.0001），而AKT抑制剂（LY294002，5μM）或mTORC1抑制剂（rapamycin，500nM）处理后，丝状伪足数量减少约60%（p<0.0001）。
产品关联：Western blot抗体购自Cell Signaling Technology（p-AKT #4060）、Proteintech（IL-15 #10398-1-AP），GTPase pulldown试剂盒购自New East Biosciences（Cdc42）、Cytoskeleton（RhoA）。
3.5 内源性IL-15对免疫治疗敏感性的增强作用
实验目的：探讨内源性IL-15与抗PD-L1治疗的协同效应。
方法细节：①皮下肿瘤模型：将Lv-mIL-15或Lv-mCtrl LLC细胞接种于C57BL/6小鼠右侧 flank（n=7/组），7天后给予抗PD-L1抗体（10mg/kg，腹腔注射），每3天1次，共3次，测量肿瘤体积；②肺转移模型：将Lv-mIL-15或Lv-mCtrl LLC细胞尾静脉注射入C57BL/6小鼠（n=5/组），5天后给予抗PD-L1抗体，9天后取肺组织行HE染色，统计转移灶面积；③免疫浸润分析：通过IHC检测肿瘤组织中CD8⁺T细胞浸润，通过流式细胞术检测CD8⁺T细胞的Ki67（增殖）、perforin（细胞毒性）表达。
结果解读：①皮下模型中，Lv-mIL-15组肿瘤生长速度较Lv-mCtrl组慢（第14天体积：1200mm³ vs 1800mm³，p<0.0001），且抗PD-L1治疗后，Lv-mIL-15组肿瘤体积进一步减少约40%（p<0.0001）；②肺转移模型中，Lv-mIL-15组+抗PD-L1组的肺转移面积较Lv-mCtrl组+抗PD-L1组减少约60%（p<0.0001）；③免疫浸润分析显示，Lv-mIL-15组肿瘤中CD8⁺T细胞密度增加约2倍（p<0.01），且Ki67⁺、perforin⁺CD8⁺T细胞比例分别增加约1.5倍、1.8倍（p<0.05~p<0.01）。
产品关联：抗PD-L1抗体购自BioLegend（#124301），流式抗体购自eBioscience（Fixable Viability Dye eFluor™780）、BD Biosciences（CD8 #553032）。
3.6 内源性与外源性IL-15的差异机制：受体复合物的不同组装
实验目的：解析内源性与外源性IL-15作用差异的分子基础。
方法细节：①外源性IL-15处理：向A549、PC9细胞中添加重组人IL-15（rIL-15，0~100ng/mL），检测迁移、RhoA活性及MLC2磷酸化；②中和实验：向过表达IL-15的细胞中添加抗IL-15中和抗体（10μg/mL），检测迁移能力；③免疫沉淀（IP）：用抗IL-15或IL-15Rα抗体沉淀细胞裂解液，检测复合物中的IL-15Rα、IL-2/IL-15Rβ、IL-2Rγ链。
结果解读：①外源性IL-15以剂量依赖方式抑制迁移（100ng/mL时迁移数减少约50%，p<0.0001），且降低RhoA活性（GTP-RhoA减少约60%，p<0.0001）及MLC2磷酸化（p-MLC2减少约50%，p<0.0001）；②中和外源性IL-15不影响过表达IL-15细胞的迁移（p>0.05），提示内源性IL-15的作用不依赖分泌至胞外；③IP结果显示，内源性IL-15仅与IL-15Rα形成复合物（无IL-2/IL-15Rβ、IL-2Rγ），而外源性IL-15处理后，IL-15Rα与IL-2/IL-15Rβ、IL-2Rγ形成三元复合物。
产品关联：重组IL-15购自PeproTech（#200-15），中和抗体购自BioLegend（#501802），免疫沉淀试剂盒购自MedChemExpress（Pierce™ protein A/G magnetic beads）。
4. Biomarker研究及发现成果解析
本研究的核心Biomarker为肺癌细胞内源性表达的IL-15，其筛选与验证遵循“临床样本-细胞模型-动物模型-临床预后”的逻辑链，揭示其作为免疫治疗敏感性预测标志物的价值。
4.1 Biomarker的筛选与验证逻辑
来源：临床肺腺癌组织及肿瘤细胞系。
筛选流程：①临床样本IHC发现肿瘤组织IL-15高表达（n=6）；②细胞系qPCR/Western blot验证IL-15表达（A549、PC9等）；③动物模型验证IL-15高表达与免疫治疗敏感性的关联（C57BL/6小鼠）；④KM plotter数据库分析IL-15表达与患者预后的关系（n=504，肺腺癌患者）。
验证方法：①定性：IHC（临床组织）、免疫荧光（细胞系）；②定量：qPCR（mRNA）、Western blot（蛋白）、ELISA（肿瘤间质液IL-15浓度）；③功能：动物模型中的转移能力及免疫治疗响应率。
4.2 Biomarker的功能关联与临床价值
预后价值：KM plotter分析显示，IL-15高表达患者的总生存期显著长于低表达患者（HR=0.76，95%CI 0.61~0.95，p=0.0202）。
免疫治疗预测价值：①动物模型中，IL-15过表达的LLC肿瘤对反PD-L1治疗的响应率较对照组高约40%（肺转移面积减少60%，p<0.0001）；②临床样本中，对反PD-1治疗响应的肺腺癌患者（n=5）肿瘤组织IL-15的平均IOD显著高于无响应患者（n=7，p<0.001）。
机制关联：IL-15高表达通过增加肿瘤间质液中IL-15浓度（ELISA检测显示，Lv-mIL-15肿瘤间质液IL-15浓度较Lv-mCtrl组高约1.5倍，p<0.05），促进CD8⁺T细胞浸润（IHC显示，CD8⁺T细胞密度增加约2倍，p<0.01）及功能激活（流式显示，Ki67⁺CD8⁺T细胞比例增加约1.5倍，p<0.05）。
4.3 Biomarker的创新性与局限性
创新性：①首次将肿瘤细胞内源性IL-15作为预测ICB疗效的Biomarker，突破了传统Biomarker（如PD-L1表达、TMB）仅反映肿瘤免疫原性的局限；②揭示IL-15的“双重角色”——虽促进迁移但增强免疫治疗敏感性，为“风险-获益”平衡的免疫治疗策略提供依据。
局限性：①临床样本量较小（IHC n=6，治疗响应分析n=12），需扩大样本验证；②未探讨IL-15与其他Biomarker（如PD-L1、TMB）的联合预测价值；③动物模型为同源肿瘤，需人源化模型进一步验证。
结论
本研究首次系统解析了肺癌细胞内源性IL-15的双重功能：一方面通过AKT-mTORC1-Cdc42轴促进细胞迁移与转移，另一方面通过增强CD8⁺T细胞浸润提高免疫治疗敏感性。肿瘤细胞内源性IL-15可作为预测肺癌免疫治疗响应的新型Biomarker，为肺癌的精准免疫治疗提供了新靶点与理论依据。未来研究需扩大临床样本验证，并探索IL-15与其他免疫调节剂的联合策略，以平衡其促转移风险与免疫激活获益。