1. 领域背景与文献引入
文献英文标题：Heterogeneous expression of EPCAM in human circulating tumour cells from patient-derived xenografts；发表期刊：Biomarker Research；影响因子：未公开；研究领域：肿瘤学-循环肿瘤细胞（CTC）研究。
癌症转移是全球癌症相关死亡的主要原因，约90%的癌症死亡由肿瘤转移引起。循环肿瘤细胞（CTC）是原发肿瘤释放进入外周血的肿瘤细胞，被认为是肿瘤转移的关键中间步骤——CTC通过血液播散并定植于远处器官，最终形成转移灶。近年来，以CTC分析为核心的“液体活检”因非侵入性、实时监测肿瘤动态等优势成为研究热点，其临床应用涵盖早期癌症诊断、复发风险预测、治疗效果监测及患者分层。然而，现有CTC检测技术存在显著局限性：多数方法依赖上皮细胞黏附分子（EPCAM）等上皮标志物（如临床常用的CellSearch系统），但肿瘤细胞在发生上皮-间质转化（EMT）后，会丢失EPCAM等上皮表型，转化为更具侵袭性的间质样CTC，这类EPCAM阴性的CTC难以被现有方法检测，导致漏检。当前CTC研究的热点是解析CTC的异质性（包括上皮型、间质型及中间型），但未解决的核心问题是“现有EPCAM依赖的检测方法无法覆盖所有CTC亚群”，限制了对CTC生物学功能及临床价值的全面理解。
针对这一瓶颈，本文提出不依赖EPCAM的CTC检测策略：利用患者来源异种移植（PDX）模型（将患者肿瘤组织移植到免疫缺陷小鼠，保留肿瘤异质性且排除人类血液细胞干扰），结合人类特异性定量逆转录PCR（qRT-PCR）技术，直接检测PDX血液中的人类CTC，旨在揭示EPCAM在CTC中的异质性表达，为开发更全面的CTC检测方法提供实验依据。
2. 文献综述解析
本文综述围绕“CTC检测的技术局限性”“现有替代方法的不足”“PDX模型的优势”三条逻辑线展开，系统评述了当前CTC研究的现状与瓶颈。
现有研究的关键结论包括：①CTC的预后价值已被多项临床研究证实（如转移性乳腺癌患者中CTC计数与生存期显著相关），但EPCAM依赖的检测方法在转移性患者中常出现“CTC阴性”结果，提示部分CTC未被捕获；②EMT后的CTC更具肿瘤发生能力（如迁移能力增强、对化疗耐药），但因丢失EPCAM而难被现有方法检测；③尺寸过滤等非标志物依赖的CTC富集方法（如利用CTC体积大于正常血细胞的特点）能提高CTC产量，但需额外的肿瘤特异性标志物验证身份，增加了实验复杂度。现有技术的优势：CellSearch系统是标准化的EPCAM依赖检测方法，适用于临床常规检测；尺寸过滤法无需抗体，能富集更多表型的CTC。局限性：EPCAM依赖的方法漏检EPCAM阴性CTC；尺寸过滤法需额外验证，易引入假阳性。
PDX模型的优势是本文综述的核心亮点：PDX模型通过移植患者肿瘤组织到免疫缺陷小鼠，能在体内保留肿瘤的异质性，且小鼠血液中无人类单核细胞污染，可精准研究人类CTC的基因表达——这为突破现有检测的局限性提供了理想模型。
本文的创新价值在于首次将PDX模型与人类特异性qRT-PCR结合：PDX模型排除了人类血液细胞的干扰，人类特异性引物确保仅检测人类CTC的基因表达，无需预富集即可分析CTC的异质性。这种方法不仅能检测EPCAM阳性的CTC，还能捕获EPCAM阴性的CTC，为全面解析CTC的分子表型提供了新工具。
3. 研究思路总结与详细解析
本文的研究目标是“开发不依赖EPCAM的CTC检测方法”，核心科学问题是“如何利用PDX模型和人类特异性qRT-PCR揭示CTC中EPCAM的异质性表达”，技术路线遵循“PDX模型建立→血液样本收集→RNA提取与逆转录→人类特异性引物设计与验证→qRT-PCR定量检测→数据统计分析”的闭环逻辑，逐步验证方法的可行性并揭示EPCAM的异质性。
3.1 PDX模型建立与血液样本收集
实验目的：构建含人类CTC的PDX模型，收集用于CTC分析的血液样本。
方法细节：将患者手术或活检获取的肿瘤组织移植到6-8周龄雌性无胸腺裸鼠（Athymic Nude-Foxn1nu）的肩胛间区，待肿瘤体积增长至>1500mm³（符合伦理要求的肿瘤大小）时，通过心脏穿刺采集血液（每只小鼠至少采集600-800μl），血液用0.5M EDTA抗凝。随后用ACK裂解缓冲液（Lonza）裂解红细胞，收集外周血单个核细胞（PBMC），冻存于液氮中备用。所有实验均获得医院伦理委员会批准及患者知情同意，小鼠实验符合法国农业食品和林业部的伦理规范。
结果解读：成功建立28个乳腺癌PDX模型，收集到28份PDX小鼠血液样本；3份样本因未检测到人类参考基因（ACTB、OAZ1）被排除，最终纳入25份样本进行后续分析。
3.2 人类特异性引物设计与验证
实验目的：设计能特异性扩增人类基因（避免小鼠基因交叉反应）的引物，为检测PDX血液中的人类CTC奠定基础。
方法细节：利用NCBI的Primer-BLAST工具设计人类特异性引物，针对ACTB（肌动蛋白β，管家基因）、OAZ1（鸟氨酸脱羧酶抗酶1，管家基因）、EPCAM（上皮细胞黏附分子）、KRT19（角蛋白19）设计引物，要求引物序列无人类与小鼠同源性，优先选择跨exon或靶向UTR的引物（避免基因组DNA污染）。通过人类乳腺癌细胞系（ZR-75-1、MCF-7、MDA-MB-231）和naive小鼠血液验证引物特异性：提取RNA并逆转录为cDNA后，进行RT-PCR和嵌套PCR（提高检测灵敏度），产物用2%低熔点琼脂糖凝胶电泳分析。
结果解读：引物能特异性扩增人类细胞系的目标基因（如EPCAM在人类细胞系中出现预期大小的条带），而naive小鼠血液中无扩增产物（图1），证明引物具有严格的人类特异性，无小鼠基因交叉反应。
3.3 定量PCR检测与数据处理
实验目的：定量检测PDX血液中人类CTC的基因表达（管家基因与CTC标志物），并处理低丰度转录本的未检测值。
方法细节：从PDX小鼠PBMC中提取总RNA（Trizol，Invitrogen），用NanoDrop ND-1000分光光度计（Thermo Fischer）评估RNA质量（A260/A280比值>1.8）。取1μg总RNA，用随机六聚体和SuperScript II逆转录酶（Life Technologies）逆转录为cDNA。为检测低丰度的人类转录本，对cDNA进行14循环预扩增（DreamTaq DNA聚合酶，Life Technologies，退火温度58℃），随后用嵌套引物进行qPCR（Bio-Rad CFX96 Touch平台，PowerUp SYBR Green Master Mix，Applied Biosystems）。以小鼠Actb（mActb）为内参基因，归一化人类基因的表达；用R语言“nondetects”包的期望最大化（EM）算法估算未检测到的Ct值（即Ct>40的样本）。
结果解读：naive小鼠血液中未检测到人类参考基因（Ct>40），证明无假阳性；25份PDX样本均检测到人类ACTB和OAZ1表达（图2），说明样本中存在人类CTC；EPCAM和KRT19的表达在不同样本中差异显著，提示CTC的异质性。
3.4 基因表达相关性分析
实验目的：分析EPCAM、KRT19与人类管家基因的表达相关性，验证EPCAM的异质性。
方法细节：用SPSS 23软件计算EPCAM/KRT19与ACTB/OAZ1的Spearman相关系数——若EPCAM在CTC中均一表达，则其与管家基因的表达应显著正相关；若存在异质性，则相关性不显著。
结果解读：人类管家基因ACTB与OAZ1的表达显著相关（Spearman’s rho=0.462，p<0.05，n=25），符合管家基因的表达特征；EPCAM与ACTB的相关性（Spearman’s rho=0.219，p>0.05，n=25）及EPCAM与OAZ1的相关性（Spearman’s rho=0.152，p>0.05，n=25）均无统计学意义（图3）；KRT19的表达模式与EPCAM类似，同样无显著相关性（图4）。这一结果提示，EPCAM在CTC中的表达并非均一——部分CTC高表达EPCAM，部分CTC低表达或不表达EPCAM，证实了CTC的异质性。
实验所用关键产品：ACK裂解缓冲液（Lonza）、Trizol（Invitrogen）、SuperScript II逆转录酶（Life Technologies）、DreamTaq DNA聚合酶（Life Technologies）、PowerUp SYBR Green Master Mix（Applied Biosystems）；仪器包括NanoDrop ND-1000分光光度计（Thermo Fischer）、Bio-Rad CFX96 Touch qPCR仪。
4. Biomarker研究及发现成果解析
本文涉及的Biomarker为上皮细胞黏附分子（EPCAM）和角蛋白19（KRT19），均为传统CTC上皮标志物。研究通过“PDX模型筛选→人类特异性qRT-PCR验证→相关性分析”的逻辑链，揭示了EPCAM在CTC中的异质性表达，为突破现有CTC检测的局限性提供了依据。
Biomarker定位与验证逻辑
EPCAM和KRT19是当前CTC检测中最常用的上皮标志物，本文旨在验证这两个标志物在CTC中的表达异质性。筛选逻辑：利用PDX模型排除人类血液细胞干扰，确保仅分析肿瘤来源的CTC；验证逻辑：通过人类特异性qRT-PCR定量检测标志物表达，结合相关性分析评估其与管家基因的关联（反映表达均一性）。
研究过程与数据解析
Biomarker来源为PDX小鼠血液中的人类CTC（排除了人类正常细胞的污染）；验证方法采用人类特异性嵌套qRT-PCR——先通过预扩增提高低丰度转录本的检测灵敏度，再用嵌套引物进行定量，确保结果的特异性和准确性；特异性通过naive小鼠血液无扩增（无假阳性）验证，敏感性通过预扩增步骤（检测低丰度CTC转录本）提高。
数据方面：25份PDX样本中，EPCAM的表达水平在不同样本中差异显著（图2），且与人类管家基因（ACTB、OAZ1）无显著相关性（p>0.05）；KRT19的表达模式与EPCAM类似，同样无显著相关性。
核心成果与创新性
①EPCAM表达异质性：首次在PDX模型中证实，EPCAM在CTC中的表达并非均一——部分CTC高表达EPCAM，部分CTC低表达或不表达EPCAM，这解释了为何现有EPCAM依赖的方法会漏检部分CTC；
②方法学创新：证明PDX模型与人类特异性qRT-PCR结合的方法能有效检测异质的CTC，包括EPCAM阴性的CTC，为开发更全面的CTC检测方法（如同时检测EPCAM和间质标志物）提供了实验基础；
③临床意义：EPCAM异质性的发现提示，仅依赖EPCAM的CTC检测可能低估患者的肿瘤负荷，需结合多标志物（如上皮+间质标志物）才能全面捕获CTC，提升临床应用价值。
统计学结果：ACTB与OAZ1的表达显著相关（Spearman’s rho=0.462，p<0.05，n=25）；EPCAM与ACTB、OAZ1的相关性均无统计学意义（p>0.05，n=25）。